一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其应用，真核表达单链抗体包括轻链可变区VL、重链可变区VH、连接肽Linker，并按照VL

【技术实现步骤摘要】
一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其用途


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其用途。

技术介绍

[0002]奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病，其中，因为金黄色葡萄球菌具有传染性且治疗用的抗生素易产生耐药性，是引起奶牛乳腺炎最重要的致病菌，流行率达到了50％，导致的经济损失最大，且很难彻底治愈。目前针对金黄色葡萄球菌全菌和各个毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的预防，但是效果均不理想。
[0003]单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体的表达形式主要有融合表达，胞内表达和分泌表达三种形式。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无Fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。
[0004]故本领域迫切需要开发免疫原性低、高特异性、能大规模工程化制备的牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体。

技术实现思路

[0005]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的是提供一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其用途。
[0006]本专利技术的技术原理是采用RT
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PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出牛抗体编码基因的重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因。
[0007]利用SOE
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PCR(重组链延伸反应)法，将linker与VH基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体编码基因(scFv)，该scFv是按照VL
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Linker
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VH的顺序进行连接的，并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中构建单链抗体初级文库，辅助噬菌体M13KO7拯救初级文库；用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，经过四轮的富集淘选后，采用phage ELISA方法筛选阳性克隆，证明该单链抗体具有抗金黄色葡萄球菌的体外中和活性，并测序后进行Clustalw多序列比较。
[0008]本专利技术的第一方面，提供了一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，包括轻链可变区VL、重链可变区VH、连接肽Linker，并按照VL
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VH的顺序连接构成牛源单链抗体片段VL
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VH，所述轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]所述牛源单链抗体片段VL
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VH氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0010]本专利技术的第二方面，提供了一种DNA分子，编码所述牛源抗金黄色葡萄球菌的真核
表达单链抗体。
[0011]本专利技术的第三方面，提供了一种抑制奶牛乳腺炎的药物，该药物包括所述牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体。
[0012]本专利技术的第四方面，提供了一钟检测奶牛乳腺炎的试剂盒，该试剂盒包括所述牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，或者含有权力要求3所述的DNA分子。
[0013]本专利技术的第五方面，提供了一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0014]步骤1、PCR扩增轻链可变区VL和重链可变区基因VH，合成scFv基因
[0015]采集患乳腺炎的奶牛血液，分离出外周血白细胞，提取总RNA，合成第1链cDNA，设计扩增抗体轻、重链的引物，采用RT
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PCR扩增抗体编码基因的轻链可变区VL基因和重链可变区基因VH基因；
[0016]利用SOE
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PCR法将连接轻链可变区VL基因和重链可变区基因，构建牛源性单链抗体基因，即scFv基因；
[0017]步骤2、建立初级单链抗体文库
[0018]将所述scFv基因和pCANTAB5E载体分别经SfiI和NotI双酶切后，scFv基因插入pCANTAB5E载体，构建重组表达质粒；
[0019]将重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；
[0020]步骤3、牛源抗金黄色葡萄球菌单链抗体的筛选；
[0021]用金黄色葡萄球菌ATCC25923全菌作为抗原，4℃包被6孔板过夜；含4％脱脂奶粉的PBS封闭，37℃孵育2h；向96孔板中加入步骤4制备的单链抗体噬菌体抗体库，37℃孵育2h，用PBST和PBS各洗10次；每孔加入100μl 0.2mol/L Gly
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Hcl缓冲液洗脱特异性结合的噬菌体，加入50μl 1mol/L Tris
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Hcl中和洗脱液；将部分洗脱液感染大肠杆菌后，重复富集淘选。
[0022]采用phage ELISA筛选,用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，筛选阳性克隆。
[0023]步骤4、真核表达单链抗体
[0024]将牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体VL
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Linker
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VH编码基因scFv插入真核表达载体pcDNA3.1，构建成单链抗体真核表达质粒pcDNA3.1
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scFv，转染COS
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1细胞。
[0025]所述抗体轻、重链的引物分别为VL F、VL R、VH F和VH R，核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，VLF、VH R分别含有SfiI和NotI酶切位点，VH F、VL R含互补的Linker序列。
[0026]PCR反应体系为25μL：2
×
PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，25μM上下游引物各1μL，ddH2O 8.5μL，PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
[0027]优选地，步骤5中富集淘选重复3
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5次。
[0028]优选地，富集淘选第一轮过后，洗脱前用PBST洗脱20次，用PBS再洗涤20次。
[0029]本专利技术的第六方面，提供了一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的应用，其特征在于，将其用于在金黄色葡萄球菌感染的乳腺组织中，抑制炎性细胞的浸润。
[0030]本专利技术的主要优点包括：
[0031]1、在构建重组牛源单链抗体表码基因(scFv)时，按照VL
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，其特征在于，包括轻链可变区VL、重链可变区VH、连接肽Linker，并按照VL
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VH的顺序连接构成牛源单链抗体片段VL
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VH，所述轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，其特征在于，所述牛源单链抗体片段VL
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VH氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。3.一种DNA分子，其特征在于包括编码权利要求1或2所述的牛源单链抗体片段VL
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VH。4.一种抑制奶牛乳腺炎的药物，其特征在于，该药物包括权利要求1或2所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体。5.一钟检测奶牛乳腺炎的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，或者含有权利要求3所述的DNA分子。6.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、PCR扩增轻链可变区VL和重链可变区基因VH，合成scFv基因采用RT
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PCR扩增抗体编码基因的轻链可变区VL基因和重链可变区基因VH基因；利用SOE
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PCR法将连接轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因，构建牛源性单链抗体基因，即scFv基因；步骤2、建立初级单链抗体文库将所述scFv基因插入pCANTAB5E载体，构建重组表达质粒；将重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体扩增建...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建国，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：