结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用，通过深入研究肿瘤患者产肠毒素脆弱拟杆菌和其分泌的毒素脆弱拟杆菌毒素蛋白的激活体形式(BFT

【技术实现步骤摘要】
结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用


[0001]本专利技术属于生物制药
，涉及一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体(B.fragilis toxin以下简称BFT
‑
211)的特异性纳米抗体，该抗体与BFT的激活体氨基酸结合位点结合，具体涉及一种结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用。

技术介绍

[0002]肠道菌群紧邻大肠黏膜，内含数以万亿计的多种微生物，这些微生物与宿主细胞相互作用以调节多种生理过程，例如能量收集，代谢和免疫反应等。拟杆菌属(Bacteroides)在人类胃肠道最为常见，约占微生物群落的25％，能够发酵各种糖并产生供宿主利用的挥发性脂肪酸。其中脆弱拟杆菌(B.fragilis)是拟杆菌属中最常见的模式种，也是所有临床分离厌氧菌株中最常见拟杆菌种。脆弱拟杆菌中的产肠毒素脆弱拟杆菌(Enterotoxigenic Bacteroides fragilis,ETBF)是一种条件致病菌，当宿主黏膜屏障受损时，可以侵入黏膜下层，引起感染腹泻，也可以经血液流动，引起其他器官感染并发脓肿。除引起腹泻和炎症性肠病外，还能够诱导癌症的发生，导致自发性肿瘤的形成，如结直肠癌以及乳腺癌。
[0003]脆弱拟杆菌毒素(B.fragilis toxin，BFT)是ETBF分泌的毒素，它的前肽区通过天冬氨酸转换机制抑制其催化结构域活性，BFT1的全长蛋白(BFT1
‑
sFL)经过加工后将具有催化活性的结构域(也称为蛋白激活体或者成熟体,以下简称为BFT
‑
211)释放到细胞外环境中，留下Pro Domain部分BFT在菌体内部。
[0004]ETBF在正常人和结直肠癌以及乳腺癌患者体内均有定植，但是并不是所有人都会致病，故而，BFT催化活性区也成为激活体(BFT
‑
211)的定量是疾病发生发展的重要指标，因此，需要建立新型、快速、准确和特异性的BFT
‑
211的诊断方法，是准确评估和研究相关疾病机制的关键，同时也是ETBF疾病治疗试验的重要前提。毒素蛋白激活体BFT1相关纳米抗体研究并未报道，对BFT
‑
211纳米抗体进行研究，可以有效弥补传统抗体稳定性差，产量低，成本高的缺陷。
[0005]因此，开发具有临床应用潜力的毒素蛋白激活体抗BFT1
‑
211的纳米抗体有极大的现实意义和应用价值。

技术实现思路

[0006]为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种结直肠癌相关脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27及其应用。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0008]本专利技术公开了一种结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27，该特异性纳米抗体Nb3.27的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]优选地，该特异性纳米抗体Nb3.27的重链包括4个框架区FR1～FR4，以及3个抗原互补决定区CDR1～CDR3；其中：
[0010]所述4个框架区FR1～FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示；
[0011]所述3个抗原互补决定区CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示。
[0012]本专利技术还公开了一种核酸，编码上述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素的特异性纳米抗体Nb3.27，该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
[0013]本专利技术还公开了一种原核表达载体，含有上述的核酸。
[0014]本专利技术还公开了一种原核宿主细胞，含有上述的原核表达载体。
[0015]本专利技术还公开了一种突变体，是以上述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27为前体，经随机突变、点突变或双特异性抗体改造，获得的特异性或靶向性增强的突变体。
[0016]本专利技术还公开了上述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素的特异性纳米抗体Nb3.27、核酸、原核表达载体、原核宿主细胞或突变体在制备抗脆弱拟杆菌毒素蛋白吸附剂中的应用。
[0017]本专利技术还公开了上述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27、核酸、原核表达载体、原核宿主细胞或突变体在制备脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的检验试剂中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0019]本专利技术通过深入研究抗脆弱拟杆菌毒素的蛋白激活体(BFT1
‑
211)，采用噬菌体展示技术对纳米抗体进行表达；通过生物淘筛技术筛选出与抗原脆弱拟杆菌毒素全长(BFT1
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sFL)的活性区域(BFT1
‑
211)具有较高结合力的纳米抗体；也称为Nb3.27。本专利技术表达并优化获得亲和力高且稳定均一的BFT1
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211纳米抗体蛋白，开辟检验人肠道细菌产肠毒素脆弱拟杆菌和脆弱拟杆菌毒素的新领域，具有良好的研究价值和应用前景。
附图说明
[0020]图1为BFT1经过加工后将具有催化活性的结构域(BFT1
‑
211)；
[0021]图2为全长蛋白BFT1
‑
sFL抗原重组蛋白纯化图；其中，(a)为经凝胶过滤层析柱Superdex75PG纯化后的蛋白结果图(b)为蛋白电泳结果；
[0022]图3用ELISA方法评价免疫效果图；
[0023]图4为用PCR方法随机挑取20个菌落计算插入率；
[0024]图5为SDS
‑
PAGE考马斯亮蓝染色结果验证纳米抗体大小和完整性实验结果；
[0025]图6为纳米抗体以及全长蛋白BFT1
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sFL抗原与纳米抗体复合物小量表达可溶性分析结果；
[0026]图7为等温滴定量热法(ITC)筛选高亲和力纳米抗体亲和力数据；
[0027]图8为Nb3.27+BFT1
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sFL复合物结晶结果；
[0028]图9为PDBePISA鉴定得出的抗原全长蛋白与纳米抗体结合的结合表位是在蛋白的激活体C段区域。
具体实施方式
[0029]为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。
[0030]需要说明的是，本专利技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27，其特征在于，该特异性纳米抗体Nb3.27的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27，其特征在于，该特异性纳米抗体Nb3.27的重链包括4个框架区FR1～FR4，以及3个抗原互补决定区CDR1～CDR3；其中：所述4个框架区FR1～FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示；所述3个抗原互补决定区CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示。3.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的结直肠癌相关的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白激活体的特异性纳米抗体Nb3.27，该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：温玉荣，郑芳，郭玉呈，
申请(专利权)人：陕西海司诺维科技有限公司，
类型：发明
国别省市：