一种鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡毒支原体HS株单克隆抗体及其制备方法，其步骤为：利用鸡毒支原体黏附蛋白pMGA 1.2为免疫原，免疫BALB/C小鼠，制备分泌鸡毒支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及单抗腹水，纯化单抗。本发明专利技术用鸡毒支原体地方分离株HS抗原免疫小鼠后，成功筛选到一株能稳定分泌鸡毒支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A1。该杂交瘤细胞株能够分泌效价高以及特异性强的鸡毒支原体HS株的单克隆抗体。本发明专利技术制备的单克隆抗体能够应用于多种途径，对实际生产具有较好的应用价值。际生产具有较好的应用价值。际生产具有较好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法


[0001]本专利技术属于动物传染病诊断和检测领域，具体涉及一种鸡毒支原体特异型单克隆抗体及其制备方法，还涉及一种分泌鸡毒支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选和选择性培养。

技术介绍

[0002]鸡毒支原体(Mycoplasma galisepticum，MG)是引起鸡慢性呼吸道疾病(Chronic respiratorydisease，CRD)的病原，既能水平传播也能垂直传播，各种年龄的鸡均可常年感染。MG感染后会引起蛋鸡产蛋率下降，肉鸡体重减轻，雏鸡弱雏率增加。自Nelson(1933)首次在鸡体内分离到MG以来，世界各国都证实该病原及相关疾病在鸡群中广泛流行，极大地威胁了养鸡业的健康发展。
[0003]MG感染主要表现为慢性呼吸道症状，引起鸡咳嗽、打喷嚏、鼻炎、结膜炎，呼吸时伴有鼻分泌物，也有可能患上单侧或者双侧鼻窦炎。目前我国鸡群MG感染阳性率高达 50％-80％，且MG极易与其他细菌或病毒继发和混合感染，使病程延长、病情加重，甚至死亡，经济损失加剧。
[0004]该病目前的防治措施主要是接种疫苗和长期使用抗菌药物。MG灭活疫苗及弱毒疫苗均存在缺陷，故临床上主要使用抗菌药物，而抗菌药物虽在短期内能抑制MG增殖，一旦停药，该病又会复发，且极易诱导耐药菌株的产生，造成鸡群隐性感染。当鸡群出现应激时再次诱发CRD，给养禽业造成巨大的经济损失。因此，早期的快速、准确诊断和治疗对该病的控制具有重要的意义。
[0005]目前该病的诊断方法主要有支原体的分离鉴定、血清抗体检测和核酸诊断等。支原体分离培养营养要求高，体外培养生长缓慢，耗时较长，不能满足临床诊断的需要；常规抗体检测方法非特异性较高；核酸诊断需要特殊仪器设备和较高的操作技能，且容易因污染核酸而出现假阳性。鸡毒支原体是一种变异性极高的原核生物，不同株表面黏附蛋白差异较大。因此，申请者针对鸡毒支原体本地分离的强毒株HS株表面相对保守且免疫原性良好的黏附蛋白pMGA1.2为抗原，获得了一株杂交瘤细胞，分泌鸡毒支原体单克隆抗体，此抗体将为鸡毒支原体病的诊断提供更为广阔的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于公开一种鸡毒支原体单克隆抗体，由杂交瘤细胞株2A1分泌，该单克隆抗体能够识别鸡毒支原体的黏附蛋白pMGA1.2，为建立特异、灵敏的ELISA检测方法提供基础。
[0007]本专利技术的另一个目的是在于提供了一种鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法，该方法利用本地分离的强毒株MG-HS的黏附蛋白pMGA1.2为免疫原，免疫BALB/C小鼠，成功筛选出能够稳定分泌特异性强、效价高的抗pMGA1.2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A1，为 MG的快速诊断、免疫防治及MG的致病机理研究奠定基础。
[0008]本专利技术的第三个目的是将杂交瘤细胞注射到实验动物腹腔中，使实验动物产生腹水而获得单克隆抗体。
[0009]该专利技术的另一个目的是在于提供了一种鸡毒支原体单克隆抗体在检测鸡毒支原体中的应用，该方法为中国鸡毒支原体相关疾病的诊断提供了灵敏、特异、且合适批量检测的新型检测手段，填补了国内鸡毒支原体抗原检测的空白。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术采用了以下的技术方案：将课题组前期在本地某鸡场分离得到的一株鸡毒支原体强毒株MG-HS，构建该鸡毒支原体粘附蛋白pMGA1.2的原核表达载体，进行融合蛋白的表达及纯化。以纯化的GST-pMGA1.2融合蛋白免疫BALB/C小鼠，用获得的免疫鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞；进一步用鸡毒支原体 pMGA1.2抗原筛选，获得能稳定分泌高亲和力鸡毒支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A1， 2A1株分泌的单克隆抗体的亚类为IgG3。
[0011]该杂交瘤细胞株2A1可以在含有40％(v/v)新生牛血清的RPMI-1640培养基中半贴壁生长，生长环境为37℃，5％(v/v)CO2的细胞培养箱。该杂交瘤细胞株体积较大，圆而透亮，成簇生长，且能稳定分泌抗鸡毒支原体的单克隆抗体。该细胞株由骨髓瘤细胞SP2/0和免疫脾细胞融合而得。
[0012]一种分泌鸡毒支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其步骤是：
[0013]1.鸡毒支原体(MG-HS)的培养：-80℃中取出MG-HS冻干粉(由华中农业大学预防兽医微生物重点实验室保存)，无菌环境接种至5mL FM-4全价培养基中，37℃恒温培养箱中培养3-5d，颜色由红变橘黄，作为原代菌株；每次颜色发生变化，从中取出0.9mL，接种至8.1mL新鲜的FM-4全价培养基中混匀，于37℃恒温生化培养箱中培养3-5d，直到颜色由红色变为橘黄。颜色变黄后取部分菌液，继续传代并测定其颜色变化单位，剩余的菌液加入终浓度为25％(v/v)的灭菌甘油混匀，-20℃保存。
[0014]2.MG-HS的活力测定：采用颜色变化单位法(color change unit，简称CCU)，是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数活的微生物的相对含量。血凝试验(HA)，是 MG细胞表面含有血凝素与红细胞表面的相应受体结合，引起红细胞凝集，可以测定MG的相对含量，确定其活性。
[0015]3.鸡毒支原体抗原的制备：按上述步骤确定的MG-HS，根据其pMGA1.2的序列构建原核载体pGEX-KG-pMGA1.2，通过酶切重组，构建重组蛋白GST-pMGA1.2与等体积的完全弗氏佐剂(CFA)乳化，作为免疫原，免疫小鼠。
[0016]4.小鼠免疫：选取6周龄的SPF雌性BALB/C小鼠6只，在每只小鼠颈背部皮下多点注射0.5mL(约含500mg蛋白)的免疫原。与首免间隔第10天、20天腹腔注射抗原0.5mL (约含500mg蛋白)，进行两次加强免疫。采集血清，用间接ELISA法测定其效价。取效价最高的小鼠脾脏进行下一步融合。
[0017]5.杂交瘤细胞以及单抗的制备：
[0018]杂交瘤细胞的制备：在细胞融合前对效价最高的小鼠进行超强免疫，三天后小鼠脱颈处死，无菌取脾脏，匀浆，静置1min吸取上层细胞液。取1
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107个SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合，用50％(v/v)的PEG1450介导细胞融合，逐渐加入基础培养基RPMI-1640稀释融合剂，终止融合，将融合细胞加入到96孔板中，于37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养细胞培养至覆盖孔底1/4大小，培养液变黄，即可吸取培养上清进行ELISA检测抗体，可根据抗体效
价挑选孔再进行克隆。
[0019]杂交瘤细胞克隆采用有限稀释法，采取阳性杂交瘤克隆转接到24孔板中扩大培养，再次克隆化筛选，进行扩大培养。
[0020]单抗腹水的制备：用灭菌液体石蜡预处理BALB/C小鼠后，再注射杂交瘤细胞的方法生产腹水。
[0021]6.单抗纯化和鉴定：
[0022]单抗纯化：含单克隆抗体的腹水用常规的辛酸-硫酸铵方法纯化，4℃保存备用(图4)。
[0023]单克隆抗体的亚型鉴定：采用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡毒支原体单克隆抗体，其特征在于：(1)成功筛选到一株能稳定分泌鸡毒支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A1；(2)得到一重链在50KDa，轻链在26KDa纯度理想的单抗；(3)通过间接ELISA方法，一抗加入采集的腹水，二抗是鼠抗IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM酶标二抗，检测到该单抗亚类为IgG3；(4)利用Western blot检测到鸡毒支原体单克隆抗体具有特异性。2.一种鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)抗原的准备：将课题组前期分离得到的一株鸡毒支原体本地分离株即MG-HS的pMGA1.2基因进行克隆、表达，提取、纯化重组蛋白；(2)免疫动物：选取6周龄的BALB/C小鼠6只，在每只小鼠颈背部皮下多点注射0.5mL/只(约含500mg蛋白)的免疫原，进行三次加强免疫，选取1、3号血清效价均达到1∶1.28
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104的小鼠进行后续融合实验；(3)制备骨髓瘤细胞和免疫脾细胞为饲养细胞；(4)细胞融合：采用50％的PEG1450作融合剂进行细胞融合，细胞融合按常规方法进行，将融合细胞接种到96孔板中，第十天左右，集落长到占孔底1/4大小，即可进行抗体检测；(5)建立了间接ELISA方法；(6)杂交瘤细胞的选择性培养与克隆：采用常...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭秀丽，符亚丽，邹梦云，莫伟强，毕丁仁，胡思顺，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：