一种基于互补介导完成的荧光PCR技术的非诊断目的的多重核酸检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于互补介导完成的荧光PCR技术的非诊断目的的多重核酸检测方法，所述的检测方法采用以下引物和探针组合：（1）一条5

【技术实现步骤摘要】
一种基于互补介导完成的荧光PCR技术的非诊断目的的多重核酸检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及多重核酸检测引物探针和检测方法，具体涉及一种基于互补介导完成的荧光定量PCR技术的多重核酸检测方法。本专利技术还涉及所述引物探针或方法用于多重核酸检测的用途。

技术介绍

[0002]自实时荧光定量PCR(Real
‑
time PCR)技术专利技术以来，该技术通过实时监测杂交探针释放的荧光信号，能够定性或者定量检测样本中的核酸。由于其具备灵敏度高、特异性强、污染少等特点，在核酸检测领域得到了广泛的应用。
[0003]传统的Taqman荧光定量PCR法，即在PCR反应体系中加入一条与靶片段两引物内的序列互补的荧光标记探针，探针为5
’
端报告基团和3
’
端淬灭基团的寡核苷酸，在PCR扩增过程中，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5
’→3’
外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后对未知模板进行定性分析或通过标准曲线进行定量分析的方法。Taqman荧光PCR通常应用一对引物和一条探针，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定；多重Taqman荧光PCR是在同一PCR反应体系里加上二对或以上引物和相应的两条或多条探针，同时扩增出两个或者两个以上核酸片段，鉴定两种或两种以上的靶片段存在与否。因此，多重Taqman荧光定量PCR检测，一管多检，准确、高效满足检测需求。
[0004]但对于突变位点密集的基因，比如人类红细胞ABO血型基因、人类红细胞RHD血型基因等，传统的多重Taqman荧光定量PCR检测方法存在着一定的不足。传统的多重Taqman荧光定量PCR技术需要设计3条序列——正向引物、反向引物、探针，一旦探针序列上存在未知突变点，将出现假阴性结果，从而导致变异型的漏检。
[0005]因此，对于突变位点密集的基因，需要一种新的检测方法，来降低假阴性，提高结果判断的准确性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供了一种基于互补介导完成的荧光PCR技术的多重核酸检测方法，旨在克服现有技术的不足之处，降低假阴性，提高结果判断的准确性。
[0007]本专利技术的原理是：提供一种互补介导完成的荧光PCR技术，包含一条5
’
端标记有FAM/HEX/ROX/CY5等报告荧光基团的单标报告探针，一条与该标记探针互补的3
’
端标记有BHQ1/BHQ2等淬灭荧光基团的单标淬灭探针，一条与目的序列匹配的引物。所述的单标报告探针5
’
端6～8个碱基为人工设计，与目的序列不匹配，剩余碱基直到3
’
端与目的序列匹配。所述的单标淬灭探针与单标报告探针除3
’
端6～8个碱基以外的剩余碱基互补。
[0008]PCR反应前，在溶液中，报告探针5
’
端与淬灭探针互补结合，没有荧光发出；
[0009]PCR变性阶段，随着反应温度升高，待检样本双链DNA打开；
[0010]PCR退火延伸阶段，报告探针3
’
端与模板结合，并在聚合酶作用下延伸，报告探针与淬灭探针分开，发出荧光信号，荧光定量PCR仪根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，从而实现对待检基因的定性分型检测。
[0011]本专利技术的技术方案如下：
[0012]本专利技术的第一个目的是提供一种基于互补介导完成的荧光PCR技术的非诊断目的的多重核酸检测方法，所述的检测方法采用以下引物和探针组合：
[0013]⑴
一条5
’
端标记有报告荧光基团的单标报告探针；
[0014]⑵
一条3
’
端标记有淬灭荧光基团的单标淬灭探针；
[0015]⑶
一条与目的序列匹配的无修饰普通引物。
[0016]其中，
[0017]所述的单标报告探针5
’
端6～8个碱基为人工设计，且与目的序列不匹配，剩余碱基直到3
’
端与目的序列匹配；
[0018]所述的单标淬灭探针与单标报告探针除3
’
端6～8个碱基以外的剩余碱基互补；
[0019]所述的普通引物为结合ARMS分析法设计的特异性引物，引物加入错配碱基。
[0020]优选地，所述单标报告探针的长度为20
‑
35bp。
[0021]优选地，所述的报告荧光基团为FAM、HEX、ROX或CY5。
[0022]优选地，所述单标淬灭探针的长度为15
‑
25bp。
[0023]优选地，所述的淬灭荧光基团为BHQ1或BHQ2。
[0024]优选地，所述普通引物的长度为15
‑
25bp。
[0025]优选地，所述单标淬灭探针与所述单标报告探针的退火温度相比低5
‑
15℃。
[0026]优选地，所述单标报告探针连接有报告荧光基团，当待检目的片段的数目为多个时，这些报告探针之间的荧光基团不同。
[0027]本专利技术的第二个目的是提供上述检测方法在非诊断目的的突变点密集基因的基因分型中的应用。
[0028]所述的突变点密集基因表示基因外显子区域存在大量的已知或未知的碱基变异。例如ABO基因7号外显子区域长度691bp，却存在着一百个以上的突变碱基，有些突变还是未知的，这给传统的Taqman荧光定量PCR在引物探针设计上增加了难度且提高了检测成本和结果假阴性率。
[0029]优选地，所述的突变点密集基因为ABO或RHD。
[0030]当所述的突变点密集基因为ABO时，采用如下表所示的单标报告探针、单标淬灭探针和引物组合进行分组检测：
[0031][0032][0033]同时每组均添加内标基因引物探针，用于监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果，序列如下：
[0034]SEQ ID No.引物探针序列5'
→
3'#305
’‑
CATCTGGACATGCTTGCT
‑3’
#315
’‑
ACACATGGAAGACCACA
‑3’
#32HEX 5'
‑
TGTTAAAGCTCTGAATAA
‑
3'BHQ1
[0035]。
[0036]引物及探针的序列见表1。
[0037]表1引物及探针序列
[0038][0039][0040]本专利技术具有如下技术效果：本专利技术提供了一种互补介导完成的荧光PCR技术，在传统Taqman荧光PCR技术基础上进行了改良，对于突变点密集的基因检测分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于互补介导完成的荧光PCR技术的非诊断目的的多重核酸检测方法，其特征在于，所述的检测方法采用以下引物和探针组合：
⑴
一条5
’
端标记有报告荧光基团的单标报告探针；
⑵
一条3
’
端标记有淬灭荧光基团的单标淬灭探针；
⑶
一条与目的序列匹配的无修饰普通引物。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的单标报告探针5
’
端6～8个碱基为人工设计，且与目的序列不匹配，剩余碱基直到3
’
端与目的序列匹配；所述的单标淬灭探针与单标报告探针除3
’
端6～8个碱基以外的剩余碱基互补；所述的普通引物为结合ARMS分析法设计的特异性引物，引物加入错配碱基。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述单标报告探针的长度为20
‑
35bp，所述的报告荧光基团为FAM、HEX、ROX或CY5。4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述单标淬灭探针的长度为15
‑
25bp，所述的淬灭荧光基团为BHQ1或BHQ2。5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述普通引物的长度...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈炤源，王浩，章婷婷，顾逸飞，
申请(专利权)人：江苏伟禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：