一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法及应用，属于基因检测技术领域，本发明专利技术将双标记自淬灭的TaqMan探针熔解曲线技术与两条邻近单标记探针联合淬灭的熔解曲线技术相结合，提出一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法及应用。本方法利用双标记自淬灭的TaqMan探针熔解曲线技术，获得正常的熔解峰，利用两条邻近单标记探针联合淬灭的熔解曲线技术获得倒置的熔解峰，实现单色荧光通道中，一个靶标的检测结果呈现正的熔解峰，另一个靶标的检测结果呈现负的熔解峰，使得单色荧光通道可同时检测至少两种靶标，本发明专利技术利用现有荧光PCR平台有限的荧光检测通道和在较窄的温度范围内单管实现多重靶标的检测，具有较大的市场和应用前景。具有较大的市场和应用前景。具有较大的市场和应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及多重基因检测
，具体为一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PC R检测方法及应用。

技术介绍

[0002]多重PCR(Multiplex polymerase chain reaction，MPCR)是指通过一次PCR反应同时对多个靶标进行扩增，结合一定的检测手段对扩增产物进行检测从而实现对多个靶标进行诊断的技术。MPCR具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤、药物基因组学等学科中有着重要的应用。
[0003]多重荧光定量PCR(Multiple fluorescencequantitative PCR)技术是在荧光定量PCR技术的基础上，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测。TaqMan水解探针(Hydrolysisprobes)是多重荧光PCR体系中常用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通过在不同序列末端标记不同荧光基团及相应的淬灭基团，即可形成不同的TaqMan水解探针，将上述探针及相应的扩增引物加至同一反应体系，即可实现对多个靶标的共同检测。分子信标(Molecular beac on)是多重PCR体系中另一种常用的探针，基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonanc e energy transfer，FRET)的原理，当体系中不存在特异性的靶标时，分子信标会自发形成茎环结构，淬灭基团与荧光基团相互接近从而发生FRET，不会产生荧光。如果体系中存在特异性的靶标，在一定的条件下，茎环结构会打开并且与靶标进行复性，从而产生荧光信号。那么在同一个反应体系中加入几种靶标特异性的分子信标就能够实现对多个靶标的同时检测。基于水解探针和分子信标探针的多重荧光定量PCR技术的优点是简便快捷，然而受仪器荧光检测通道的限制，往往最多只能达到四重或五重检测。
[0004]非特异性的荧光染料嵌入到DNA双链小沟中后，在特定的激发光激发后将会产生一定波长的荧光。以此为基础发展了熔解曲线(Meltingcurve)分析法，利用不同DNA序列具有不同Tm(Melting temperature)值的特征，在PCR反应结束后，通过程序升温使双链逐渐解链成单链，当达到双链特异的Tm值所对应的温度时，荧光强度大幅度降低，利用这样的原理可以对PCR中不同长度的双链产物或相同长度不同GC含量的双链进行分析。在熔解曲线分析技术的基础上发展而来的高分辨率熔解曲线技术是一种利用饱和染料，借助高分辨率的仪器，实现对单个核苷酸熔解温度不同从而形成不同形态熔解曲线，进而对基因进行分析的新技术，它具有极高的灵敏度，能够检测出单个碱基之间的差别，目前主要应用于单核苷酸多态性分析、甲基化分析、基因突变、基因分型等领域。但基于荧光染料的多重PCR技术由于染料不具备特异性的识别能力，所以同一反应体系中通常只能使用一种荧光染料。
[0005]为了弥补这两种方法的不足而开发出来的荧光探针熔解曲线技术(Fluorescence probe melting curve technique)具有成本低、多重检测能力更强的优点。通过在靶序列中选取相对保守的区域设计通用扩增引物，然后在引物对之间选取差异度较大的区域设计能够识别各种目标核酸序列的特异性探针，探针在扩增的过程中不会被完全水解，并且根
据检测通道的不同将探针进行分组，每个通道中包含多个特异性探针，通过调整探针的长度或GC含量对每条探针的Tm值进行人为的调控，使得同一检测通道内针对不同靶标的检测探针Tm值都间隔合适的差值，每个荧光通道均可定性检测多个靶标，最后通过熔解曲线进行分析。但该技术对引物探针设计要求较高，要求每一引物具有良好的特异性，无引物二聚体和非特异性扩增生成，且不同的探针Tm(熔解温度)值相差大于2℃，使得反应体系和反应条件的优化困难，且往往满足这些要求之后，难以保证Tm接近的探针可以有效区分。
[0006]基于微流控芯片(Microfluidic chip)的多重PCR技术通过在芯片微孔中预装填不同的引物对的方法将各重扩增限制在各自的独立空间内，再通过液流控制系统将模板引流到不同的微孔中，进而在微孔中进行特异的PCR扩增反应，最后再进行终点定性检测，从而实现对多个靶标的区分和鉴别，基于微流控芯片的多重PCR技术的优点是在一定程度上避免了非特异性扩增产物的生成以及在荧光定量PCR的基础上增加了检测重数。但是当模板浓度较低时，基于微流控的方法将模板分流至含特异性引物微孔中的概率降低，易产生假阴性结果，此外在检测方面，该技术需要配合扩增的特殊性而使用到高精密度的检测仪器，其技术的复杂性使其实现和临床推广应用较为困难。
[0007]液相芯片技术(Liquid chip technology)被称为后基因组时代的芯片技术，也被称为x MAP技术。它可以同时对1份标本中的100种不同目的分子进行检测，并能在30min内检测96个不同的样本。其液相微球编码原理为，将两种荧光染料分别用10种不同的浓度两两混合形成10
×
10的荧光配比阵列，并对微球进行染色，得到100种不同荧光编码的微球。将荧光编码且共价结合了不同捕获探针的微球悬浮于一个液相体系中，先加入待检测分子与其反应，再加入带有荧光标记的报告分子，从而形成“微球
‑
捕获探针
‑
靶标
‑
报告分子”复合物。检测时，该复合物在鞘液的作用下将逐个通过检测通道，接受两束不同波长的激发光照射并对相应的发射光进行检测，其中一束激光用于识别微球种类，即判定该种微球是对哪种特定的靶标进行检测，另一束激光用于检测微球上报告分子的荧光强度，从而实现对待测物质的定性和定量分析。但是由于需要将引物束缚至固相载体，这在一定程度上限制了引物与模板的碰撞概率并且导致其扩增效率降低，Luminex微珠法成本明显高于荧光PCR平台，且所需设备昂贵，普及程度较低。
[0008]综上，现有的PCR检测手段存在多重检测能力差、检测通量低、检测成本高、检测的靶目标Tm值差异不明显时难以区分的问题，难以应用于需要多重PCR检测的应用领域。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于：提供一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法及其应用，解决多重荧光探针熔解曲线技术中引物及探针的设计难度高，多重靶标区分能力有限的难题，为临床提供一种检测成本低、通量高、多重检测能力更强的多重PCR检测方法，适用于在各个医疗、科研等领域的推广应用。
[0010]本专利技术采用的技术方案如下：
[0011]一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法，包括如下步骤：
[0012]S1：根据靶标基因位点序列，分别设计具有相同单色荧光通道的特异性上游引物、下游引物和探针序列，所述靶标基因位点的数量至少为2种；每两个靶标基因位点中，靶标基因位点A的探针为双标记自淬灭TaqMan探针，且5...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：根据靶标基因位点序列，分别设计具有相同单色荧光通道的特异性上游引物、下游引物和探针序列，所述靶标基因位点的数量至少为2种；每两个靶标基因位点中，靶标基因位点A的探针为双标记自淬灭TaqMan探针，且5
’
端标记荧光基团，3
’
端标记淬灭基团，靶标基因位点B的探针为两条邻近单标记联合淬灭探针P1、P2，探针P1的3
’
端标记淬灭基团，探针P2的5
’
端标记荧光基团，3
’
端磷酸化封闭处理，探针P1的长度大于探针P2；S2：配制多重PCR反应体系，所述多重PCR反应体系包括每种所述靶标基因的特异性探针、每种所述靶标基因的特异性上游引物和下游引物；S3：进行PCR扩增，在PCR扩增周期结束后，进行熔解曲线分析，并根据熔解峰形状及熔解峰Tm值的差异判断多重单核苷酸的基因型。2.根据权利要求1所述的一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述双标记自淬灭TaqMan探针序列长度介于18bp～30bp，T
m
值介于45℃～75℃；所述单标记探针P1序列长度介于23bp～30bp，T
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值介于50℃～75℃；单标记探针P2序列长度介于15bp～25bp，T
m
值介于45℃～70℃。3.根据权利要求1所述的一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、ROX、CY5，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3。4.根据权利要求1～3任一所述的一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤S2中，靶标基因位点A的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵瑞瑞，童京京，刘淑莉，朱怡倩，曲径，
申请(专利权)人：郑州华之源医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：