一种氨基糖苷类抗生素适配体、其亲和柱及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种氨基糖苷类抗生素适配体、其亲和柱及其制备方法和应用。本发明专利技术提供的氨基糖苷类抗生素核酸适配体，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，亲和柱是以N

【技术实现步骤摘要】
一种氨基糖苷类抗生素适配体、其亲和柱及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于农业、食品和环境检测
，具体涉及一种氨基糖苷类 抗生素适配体、其亲和柱及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]氨基糖苷类抗生素(AGs)是一类广谱抗生素，多为极性化合物，易溶 于水，其分子是由一个氨基环醇和一个或多个氨基糖分子通过苷键连接而成。 AGs大部分是由不同种类的链霉菌和小单孢菌产生的，如卡那霉素、新霉素、 链霉素、庆大霉素、妥布霉素和大观霉素等，还有一些是人工半合成的，如 奈替米星、阿米卡星和阿贝卡星等。AGs作为一种重要的抗菌药物主要是通 过抑制细菌蛋白质合成过程和破坏细菌细胞膜的完整性而发挥杀菌作用的， 临床上主要用于治疗革兰氏阴性菌如肠杆菌属、克雷伯菌属、变形菌和铜绿 假单胞菌以及葡萄球菌引起的各种中重度呼吸系统感染、尿路感染、肠道感 染、皮肤及软组织感染等，链霉素和阿米卡星等药物还可以用于结核病的二 线治疗。AGs价格低廉且具有良好的抑菌效果，不仅在临床中有着广泛应用， 也被大量用于畜牧业中，作为兽药和生长因子使用。然而AGs对人体的肾 毒性和耳毒性等副作用较为明显。若过度使用抗生素，这些抗生素一部分被 排出体外，对环境造成污染，另一部分残留在动物体内，随着食物链累积传 递，最终都进入人体，从而给人体健康带来了巨大危害，而且抗生素的滥用 会加速抗生素耐药性的传播，使人体免疫力降低。鉴于AGs残留的危害，目 前许多国家都规定了AGs的最高残留限量(maximum residue limit，MRL)。
[0003]目前肥料、食品、饲料和粮食样品中的氨基糖苷类抗生素检测方法主要 有微生物法、免疫分析法、高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。酶联 免疫吸附分析法(ELISA)作为一种重要的免疫分析方法，是目前最受欢迎 的抗生素残留快速检测方法之一。相关学者已经用单克隆抗体直接竞争的方 法测定了动物牛奶和血浆中的新霉素和链霉素残留量，该方法具有较高的特 异性，与其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应，建立了牛奶中快速筛选检测方 法。免疫分析方法虽然操作简单，但检测耗时较长且试验结果误差较大，对 结构类似的抗生素有一定的交叉干扰，容易发生假阳性。高效液相色谱法和 液质联用法等仪器分析方法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点， 是目前常用的方法。但AGs是一种极性很强的化合物，在传统的反向液相色 谱中保留性较差，并且AGs缺少发色团和荧光团，因此不能直接使用紫外或 荧光检测器进行检测，一般采用衍生法将其衍生后再用紫外检测器或荧光检 测器进行检测。利用衍生器的HPLC检测方法使仪器条件更为复杂，额外的 前处理步骤会导致分析物质的损失，过量的试剂和衍生产物也可能会对分析 结果产生干扰。液相色谱串联质谱分析法检测灵敏度高、检测限低、定量准 确，是目前国际上公认的AGs定量方法。国内外已经建立了乳制品中链霉素、 卡那霉素等10种AGs残留的高效液相色谱串联质谱检测方法。乳制品提取 液经亲水亲脂平衡柱净化后，采用反相离子对高效液相色谱分离，电喷雾串 联四极杆质谱检测。但AGs类化合物结构相似导致碎片化后离子相似，
使 AGs的定量检测面临重大挑战。此外，使用LC
‑
MS/MS进行AGs检测需要 使用挥发性流动相添加剂，这将不利于仪器的长期维护。利用仪器分析法检 测时需要对样品基质进行预处理，AGs具有强极性，在水溶液中以聚阴离子 的形式存在，因此提取过程具有诸多困难，通常采用固相萃取(SPE)法提 取净化，由于SPE法选择性较低，样品在处理后会有一定的损失，不可避免 地为最终定量结果带来误差。因此，建立高选择性、快速有效的样品前处理 技术已成为氨基糖苷类抗生素检测分析中亟需解决的重要问题。发展高选择 性、高效率的吸附剂是目前固相萃取技术的主要研究方向，基于核酸适配体 功能化材料的SPE方法具有高选择性和强特异性的特点，近年来受到广泛关 注。
[0004]适配体本质上是具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标的一段脱氧 核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列(10～100个碱基)。单链的核 酸序列可以形成二级结构，从而对可结合的配体有严格的识别能力和高度的 亲和力。通过构建单链随机寡核苷酸文库，利用指数富集配体系统进化技术 (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)进行多 次富集和筛选，体外优选出能特异性与靶标高度亲和的核酸适配体，从而避 免了体内免疫反应带来的困难。适配体作为一种在体外人工合成的，与抗体 功能类似的新型分子，与主流的抗体技术相比，其研究还处于起步阶段，但 是已经表现出一些有别于抗体的优势，如批次间稳定性一致，易修饰，无免 疫原性等。
[0005]基于适配体的亲和柱是一种新型高效的样品前处理技术。它的原理是利 用适配体对靶分子的选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化， 这种吸附是可逆的。适配体亲和柱结合常规仪器分析已成为痕量污染物分析 的一个重要发展方向。
[0006]目前，国内外报道的适配体亲和柱主要针对赭曲霉毒素和黄曲霉毒素， 且主要针对单一靶标，目前，国内外可以富集净化一类具有共同母核化合物 的适配体亲和柱尚未见报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种氨基糖苷类抗生素适配体，本专利技术的另一目 的在于提供氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱及其制备方法。本专利技术的再一目 的在于提供氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱在富集和纯化，以及净化样品中 氨基糖苷类抗生素中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案 为：
[0008]一种氨基糖苷类抗生素核酸适配体，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]如上所述氨基糖苷类抗生素核酸适配体在制备检测试剂、检测试纸条、 检测试剂盒、亲和柱或在检测中的应用。
[0010]本专利技术提供所述适配体的以下任一应用：
[0011](1)在制备氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱中的应用；
[0012](2)在制备氨基糖苷类抗生素的检测试剂、检测试纸条或检测试剂盒中 的应用；
[0013](3)在氨基糖苷类抗生素检测中的应用。
[0014]进一步优选地，如上所述的氨基糖苷类抗生素包括TOB(妥布霉素)、 KANA(卡那霉素A)、KANB(卡那霉素B)、AMI(丁胺卡那霉素)。
[0015]本专利技术提供的一种氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱，所述亲和柱的填料 是以N
‑
羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将如上所述的核酸适配体 (SEQ ID NO:1)与载
体进行共价偶联得到的。
[0016]优选地，所述适配体是经过化学修饰的适配体序列，修饰方式包括但不限于氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。
[0017]更优选地，所述适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3
’
或5
’
端通过共价键连本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氨基糖苷类抗生素核酸适配体，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的核酸适配体在制备检测试剂、检测试纸条、检测试剂盒、亲和柱或在检测中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为所述的DNA适配体在制备氨基糖苷类抗生素的检测试剂、检测试纸条或检测试剂盒中的应用；或在制备氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱中的应用；或在氨基糖苷类抗生素检测中的应用。4.一种氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱，其特征在于，所述亲和柱的填料是以N
‑
羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将权利要求1所述的核酸适配体与载体进行共价偶联获得。5.根据权利要求4所述的亲和柱，其特征在于，所述核酸适配体为经过化学修饰的适配体序列，修饰的方式为氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。6.根据权利要求4所述的亲和柱，其特征在于，所述DNA适配体的3
’
或5
’
端先通过共价键连接C7间接臂(
‑
(CH2)7‑
)或C6间接臂(
‑
(CH2)6‑
)，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，得到氨基修饰的适配体之后，再与载体进行共价偶联。7.如权利要求4所述氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：1)NHS修饰的琼脂糖的制备：将琼脂糖凝胶4FF先用丙酮洗涤后用二氧六环洗涤，之后与二氧六环、烯丙基缩水甘油醚、三氟化硼乙醚混合反应后，所得基质用丙酮洗涤，最后用去离子水洗涤干净，得到活化基质，将活化基质加入巯基乙酸、去离子水和过硫酸铵反应获得基乙酸羧化的琼脂糖凝胶；将巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶先用丙酮溶液清洗，再...

【专利技术属性】
技术研发人员：栾云霞，王楠，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：