一种双特异性的NK细胞激动剂及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种双特异性的NK细胞激动剂及制备方法和应用。本发明专利技术提供一种融合蛋白，其以CD16A受体和4

【技术实现步骤摘要】
一种双特异性的NK细胞激动剂及制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体地，涉及一种双特异性的NK细胞激动剂及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]NK细胞是固有免疫系统的主要效应细胞，相比于T细胞，NK细胞能无需预先刺激，通过使用穿孔素和颗粒酶以及相关机制，可以无MHC限制性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞。NK细胞表达众多的活化性受体，能有效识别肿瘤细胞或感染细胞产生的应激性配体，从而有效杀伤肿瘤细胞，但是同时肿瘤细胞也会分泌产生许多免疫抑制性的分子，形成免疫抑制性的肿瘤微环境，抑制处于该环境中NK细胞的活性及抗肿瘤能力的发挥；使NK细胞处于耗竭状态。目前，也有许多策略用于恢复肿瘤微环境中NK细胞的耗竭，例如免疫检查点阻断，活化性抗体，活化性细胞因子等等，这些方法可以给NK细胞提供活化信号或阻断肿瘤微环境中的抑制信号，使NK细胞恢复正常的活化状态，发挥抗肿瘤或抗病毒的功能
[0003]CD16A是NK细胞上表达的一类重要的活化性受体，当CD16A被其配体或者抗体结合活化后，会诱导各种级联激活反应，释放颗粒酶、穿孔素、炎性细胞因子和趋化因子，这会为NK细胞带来强大的活化效应及抗肿瘤能力的增强，同时会使4
‑
1BB受体表达出现短暂的上调。4
‑
1BB受体是TNF受体超家族成员之一，4
‑
1BB主要在活化后的NK细胞，T细胞上以三聚体的形式表达，其配体为4
‑
1BBL，也是目前发现的唯一的天然存在的配体，当4
‑/>1BBL与4
‑
1BB结合后，会使4
‑
1BB受体活化，该过程会给NK细胞带来一定的活化效应以及ADCC效应的增强。
[0004]目前，关于NK细胞激动剂的研究报道尚少，现有的NK细胞激动剂活化NK细胞能力有限，仍有待进一步改进。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提供一种融合蛋白，其以CD16A受体和4
‑
1BB受体作为靶点，获得一种新的双特异性的NK细胞激动剂药物，用于活化NK细胞，增强其抗病毒和抗肿瘤的能力，同时具有潜在的促进NK细胞增殖及增强T细胞功能的效应。
[0006]为此本专利技术第一方面提供一种融合蛋白。根据本专利技术的实施例，所述融合蛋白包括CD16A单链抗体和4
‑
1BBL胞外区，其中，所述CD16A单链抗体和4
‑
1BBL胞外区连接，所述4
‑
1BBL胞外区包括至少1
‑
3个4
‑
1BBL胞外结构域。
[0007]专利技术人发现，以CD16A受体和4
‑
1BB受体作为靶点，选择单链CD16A抗体和4
‑
1BBL的胞外段区域，设计一种新型双特异性的NK细胞激动剂药物scfv
‑
CD16A/Trimer
‑4‑
1BBL。该NK细胞激动剂药物在单链CD16A抗体识别CD16A受体后，通过融合蛋白另一端的4
‑
1BBL的胞外段区域识别4
‑
1BB受体，从而导致NK细胞的增殖增加。其中将单链的anti
‑
CD16A抗体与1
‑
3个，优选3个4
‑
1BBL胞外段连接，构建出的双特异性的NK细胞激动剂药物，用于活化NK细
胞，增强其抗病毒和抗肿瘤的能力，同时具有潜在的促进NK细胞增殖及增强T细胞功能的效应。本专利技术提供的scfv
‑
CD16A/Trimer
‑4‑
1BBL融合蛋白通过与CD16A受体和4
‑
1BB受体的结合来协同活化NK细胞，逆转NK细胞的耗竭状态，增强NK细胞的抗肿瘤能力。本专利技术提供的scfv
‑
CD16A/Trimer
‑4‑
1BBL融合蛋白可有效扩增NK细胞，提高NK细胞纯度及扩增倍数。
[0008]根据本专利技术的实施例，所述融合蛋白还包括以下附加技术特征中的至少之一：
[0009]根据本专利技术的实施例，所述4
‑
1BBL胞外区包括3个4
‑
1BBL胞外结构域，3个所述4
‑
1BBL胞外结构域顺次连接。
[0010]3个4
‑
1BBL胞外结构域与CD16A单链抗体相连形成scfv
‑
CD16A
‑
Trimer
‑4‑
1BBL。scfv
‑
CD16A
‑
Trimer
‑4‑
1BBL具有在体外活化扩增NK细胞的活性，且扩增后的NK细胞具有较好的细胞毒性。
[0011]根据本专利技术的实施例，所述CD16A单链抗体和4
‑
1BBL胞外区通过柔性接头相连。
[0012]根据本专利技术的实施例，3个所述4
‑
1BBL胞外结构域之间通过柔性接头相连。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述融合蛋白是由非哺乳细胞表达体系表达的。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述非哺乳细胞表达体系包括原核表达体系和低级真核表达体系中的至少之一。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述非哺乳细胞表达体系包括大肠杆菌表达体系、酵母表达体系中的至少之一。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述酵母表达体系包括毕赤酵母表达体系。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述CD16A单链抗体包括V
H
区和V
L
区，所述V
H
区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述V
L
区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述V
H
区和V
L
区之间通过第一接头连接。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述第一接头为柔性接头。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述第一接头的长度为10～20个氨基酸。
[0021]根据本专利技术的实施例，所述第一接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0022]CD16A单链抗体的V
H
区的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:1所示：
[0023]QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKF QGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS
[0024]CD16A单链抗体的V
L
区的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:2所示：
[0025]SYVLTQPSSVSVAPG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括CD16A单链抗体和4
‑
1BBL胞外区，其中，所述CD16A单链抗体和4
‑
1BBL胞外区连接，所述4
‑
1BBL胞外区包括至少1
‑
3个4
‑
1BBL胞外结构域。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述4
‑
1BBL胞外区包括3个4
‑
1BBL胞外结构域，3个所述4
‑
1BBL胞外结构域顺次连接。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD16A单链抗体和4
‑
1BBL胞外区通过柔性接头相连；任选地，3个所述4
‑
1BBL胞外结构域之间通过柔性接头相连。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是由非哺乳细胞表达体系表达的；任选地，所述非哺乳细胞表达体系包括原核表达体系和低级真核表达体系中的至少之一；任选地，所述非哺乳细胞表达体系包括大肠杆菌表达体系、酵母表达体系中的至少之一；任选地，所述酵母表达体系包括毕赤酵母表达体系。5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD16A单链抗体包括V
H
区和V
L
区，所述V
H
区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述V
L
区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；任选地，所述V
H
区和V
L
区之间通过第一接头连接；任选地，所述第一接头为柔性接头；任选地，所述第一接头的长度为10～20个氨基酸；任选地，所述第一接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。6.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述V
H
区或V
L
区的一端与所述4
‑
1BBL胞外区通过第二接头相连；任选地，所述第二接头为柔性接头；任选地，所述第二接头的长度为10～20个氨基酸；任选地，所述第二接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述4
‑
1BBL胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，3个所述4
‑
1BBL胞外结构域之间两两分别通过第三接头和第四接头连接，所述第三接头和第四接头之间相同或不同；任选地，所述第三接头和第四接头均为柔性接头；任选地，所述第三接头和第四接头的长度为15～25个氨基酸；任选地，所述第三接头的氨基酸序列如SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖卫华，田志刚，李洋阳，谢思奇，陈敏华，
申请(专利权)人：上海恩凯细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：