融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种融合蛋白。该融合蛋白包括：靶向抗体以及TGFβ信号阻断因子，所述靶向抗体包括Fab区和Fc区，所述Fc区具有A327Q、G237A和L235A突变。根据本发明专利技术实施例的融合蛋白在靶向抗体的介导下，实现了TGFβ信号阻断因子在靶向区域的聚集，增加了药效，促进抗肿瘤免疫反应，且有效延长了TGFβ信号阻断因子的半衰期，更为重要的是，根据本发明专利技术实施例的融合蛋白与Fc受体(FcR)的结合力弱，ADCC效应低，药物的毒副作用显著降低。药物的毒副作用显著降低。药物的毒副作用显著降低。

【技术实现步骤摘要】
融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体地，涉及融合蛋白及其应用，更具体地，涉及靶向抗体以及TGF β信号阻断因子的融合蛋白，以及编码这类融合蛋白的核酸、构建体、重组细胞、药物组合物及其制药 用途。

技术介绍

[0002]抗体的Fc区与许多Fc受体及配体相互作用，行使一系列重要的功能，称为效应器功能 (effector function)。IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，IgE的为FcεR，IgA的为FcαR等等。已经鉴 定了FcγR的三个亚类：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。Fc受体的另一种类型是新 生Fc受体(FcRn)。
[0003]由抗体Fc区介导的效应功能可以分为两种：(1)在抗体与抗原结合之后发挥作用的效应功能(这些功 能涉及参与补体级联反应或Fc受体(FcR)
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负荷细胞)；和(2)不依赖于抗原结合而发挥作用的效应功能(这 些功能提供在血循环中的持续性和通过胞吞作用穿过细胞屏障的能力)。
[0004]近年来抗体Fc区常用来制备各种融合蛋白，融合蛋白的Fc段能够与各类免疫白细胞上表达的Fc γRs受体结合，从而产生Fc段介导的细胞毒作用(ADCC)以及补体依赖的细胞毒性(CDC)效应， 靶向杀伤功能蛋白受体阳性细胞，会影响融合蛋白发挥活性而为减弱治疗类融合蛋白Fc段与FcγRs受 体的亲和力而设计的基因突变，通常会导致融合蛋白与FcRn受体亲和力的下降，降低其在体内的半衰 期。
[0005]血管生成是从先前存在的脉管系统发展出新血管的过程。它在胚胎发育，组织正常生长，伤口愈合 中起重要作用，并且在许多疾病中起主要作用。在哺乳动物中，主要分离出5种参与血管生成的细胞因 子(Vascular endothelial growth factors,VEGFs)。这些细胞因子主要结合3种受体酪氨酸激酶—— VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3，以及一些共受体，包括硫酸肝素蛋白多糖(HSPGs)和神经毡蛋白。
[0006]VEGFR受体中，VEGFR1促进单核细胞和巨噬细胞的迁移。VEGFR1的可溶形式可以捕获VEGF， 竞争VEGF与VEGFR2的结合。VEGFR2参与正常生理过程和肿瘤的发生发展。VEGFR3对淋巴表皮 细胞发育起重要作用。
[0007]在哺乳动物中，主要有5个VEGF细胞因子，包括VEGF
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A、VEGF
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B、VEGF
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C、VEGF
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D以及胎 盘生长因子(PlGF)。VEGF诱导血管生成和内皮细胞增殖，在调节血管生成中起重要作用VEGF
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A有 几种剪接变体。主要的氨基酸包括：121、165、189和206个氨基酸，每个氨基酸都包含特定的外显子 添加。VEGF
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A转录在缺氧时被激活并被激活的癌基因增强的转录因子，缺氧诱导因子
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1α(HIF
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1α)。 正常氧中的VEGF转录被许多致癌基因激活，包括H
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ras和几个跨膜酪氨酸激酶，例如表皮生长因子受 体和ErbB2。与正常组织相比，这些途径共同导致了肿瘤中VEGF
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A的明显上调，并且通常具有预后意 义。
[0008]VEGF牵涉到与血管生成增强有关的其他几种病理状况。例如，VEGF在牛皮癣和类风湿性关节炎 中均起作用。糖尿病性视网膜病变与高眼内VEGF水平有关。VEGF功能的抑制
可通过阻断黄体功能导 致不孕，阻断VEGF或者VEGFR2的抗体已直接证明了VEGF在肿瘤生长中的重要性。因此，对VEGF 功能的干扰已成为以阻断血管生成为目的的肿瘤药物开发的重要方向。
[0009]转化生长因子
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β(transforming growth factor
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β,TGF
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β)是属于调节细胞生长和分化的TGF
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β超家 族。这一家族除TGF
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β外，还有活化素、抑制素、缪勒氏管抑制质和骨形成蛋白。机体多种细胞均可 分泌非活性状态的TGF
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β。在体外，非活性状态的TGF
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β又称为latency associated peptide(LAP)，通 过酸裂解可被活化。在体内，酸性环境可存在于骨折附近和正在愈合的伤口。蛋白本身的裂解作用可使 TGF
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β复合体变为活化TGF
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β。
[0010]TGF
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β在细胞的生长、分化和免疫功能中发挥重要的调节作用。
[0011]TGFβ可以抑制丝裂原、同种异体抗原刺激的T细胞增殖或IL
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2依赖的T细胞生长，也可以抑制 IFN
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γ诱导黑素瘤细胞MHCⅡ类抗原表达，并且，TGFβ还可以抑制PBMC中IFN
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γ和TNF
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α的产 生，并促进IL
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6的表达。
[0012]TGFβ在肿瘤中，以细胞背景依赖的方式发挥肿瘤抑制或肿瘤促进的作用。TGF
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β能够抑制原癌 基因c
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myc的表达，但在肿瘤发展过程中，随着突变的引入或表观遗传修饰的变化后，癌细胞逐渐耐受 TGFβ信号的抑制作用，最终导致肿瘤的发展。
[0013]近年的研究发现，肿瘤微环境中TGFβ增加与免疫逃逸相关，TGFβ的增加会增加T细胞排斥， 阻断TH1效应T细胞的浸润。Tauriello等人发现TGFβ阻断使小鼠肝转移癌症模型对PD1/PDL1疗法 更敏感，而类似的Mariathasan等人报道了TGFβ阻断和PD
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L1抗体联用，可以下调基质细胞的TGFβ 信号通路，促进T细胞渗透进肿瘤中，激活强烈的抗肿瘤免疫反应。

技术实现思路

[0014]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。现有技术中，单独的采用靶向拮抗 VEGF或VEGFRs的抗体，药效有限；单独采用靶向TGFβ受体2的抗体疗法临床前试验效果一般， 并且I期临床毒性很大；单独的采用靶向TGFβ的抗体会与游离的TGFβ结合，结合之后被细胞内化， 这种抗体/细胞因子复合物会被吞噬细胞吞噬并降解；单独的采用靶向拮抗VEGF或VEGFRs的抗体与 细胞因子结合后可能起到载体作用，从而抗体/细胞因子复合物常常以循环槽(circulating sink)作用积 累，最终崩解，将细胞因子释放到循环中。
[0015]为了解决上述问题，本专利技术提出了一种双功能分子的融合蛋白，其包括(a)TGFβRII或其他能够结 合TGFβ的片段，和(b)结合至血管生成因子受体(VEGFR)蛋白质的抗体或其抗原结合片段。所述融 合蛋白可应用于癌症的治疗。
[0016]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种融合蛋白。根据本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括：靶向抗体以及TGFβ信号阻断因子，所述靶向抗体包括Fab区和Fc区，所述Fc区具有A327Q、G237A和L235A突变。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向抗体为靶向VEGF或VEGFRs的抗体；任选地，所述VEGF包括选自VEGF
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A、VEGF
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B、PlGF、VEGF
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A、VEGF
‑
B、VEGF
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E、PlGF
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2、VEGF
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A、VEGF
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C、VEGF
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D、VEGF
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E、VEGF
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F、VEGF
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A、VEGF
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C、PlGF
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2、VEGF
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C、VEGF
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D的至少之一；任选地，所述VEGFRs包括选自VEGFR1、NRP
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1、VEGFR2、NRP
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2、VEGFR3的至少之一；任选地，所述靶向抗体为靶向VEGFR2抗体；任选地，所述靶向抗体特异性结合VEGFR的胞外区。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:4～6；任选地，所述靶向抗体含有分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列和分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；任选地，所述靶向抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：路力生，张轶博，霍永庭，潘志福，芦迪，涂晶晶，罗甜，
申请(专利权)人：广东菲鹏制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：