乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法技术

本申请涉及生物组织工程技术领域，公开一种乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法，所述乳腺癌类器官培养液包括完全培养基和自源条件培养基；完全培养基包括基础培养基、复合抗生素和生长因子；自源条件培养基是利用肿瘤相关成纤维细胞培养基对乳腺癌组织提取的纤维细胞进行培养获得。培养液各组分之间协同作用，加快乳腺癌类器官细胞的形成和生长，增加细胞收获数量的同时还提高培养速度；而且体外培养的类器官更加仿生，能够适用于乳腺癌类器官的个性化培养，能够维持每一例病人原发组织的形体结构与病理特征。原发组织的形体结构与病理特征。原发组织的形体结构与病理特征。

【技术实现步骤摘要】
乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法


[0001]本申请涉及生物组织工程
，例如涉及一种乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法。

技术介绍

[0002]乳腺癌是我国的十大恶性肿瘤之一。目前，乳腺癌的病因尚未完全清楚，目前认为主要是环境因素与遗传因素综合作用的结果。乳腺癌类器官对研究具有很重要的意义。目前虽有一些乳腺癌类器官培养基的研究报道，但是其培养过程生长慢，增加时间投入成本；且仿生性低。而且，由于乳腺癌的穿刺样本小，培养成功率低。
[0003]在实现本申请实施例的过程中，发现相关技术中至少存在如下问题：现有乳腺癌类器官的培养过程中，每次传代至少需要培养14天，甚至更多天，才达到传代要求。而且，获得的细胞量少，为了收获更多的细胞，进行下游试验，需要时间更长，使得整个器官的构建过程缓慢，导致乳腺癌类器官研究的时间成本高，除此之外，更为重要的是，类器官体外培养一段时间后，会发生EMT转变，逐渐丧失体内的间质特性，跟体内真实的肿瘤特性差异会比较大。另外，针对乳腺癌穿刺样本还存在培养成功率低的问题。

技术实现思路

[0004]为了对披露的实施例的一些方面有基本的理解，下面给出了简单的概括。所述概括不是泛泛评述，也不是要确定关键／重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围，而是作为后面的详细说明的序言。
[0005]本申请实施例提供一种乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法，以加快乳腺癌类器官细胞的生长，提高培养速度；而且体外培养的乳腺癌类器官更加仿生，能够保持器官的间质特性；而且提高了穿刺样本的培养成功率。
[0006]在一些实施例中，所述乳腺癌类器官培养液，其中，所述完全培养基包括条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子；所述基础培养基包括Advanced DMEM/F12（优化后的杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F
‑
12），HEPES（4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸） 5～15 mM和Glutamax 0.5x～1.5x；所述复合抗生素包括Primocin 50～500 μg/mL，青霉素
‑
链霉素0.5x～1.5x和甲硝唑2～10 μg/mL；所述生长因子包括：EGF（表皮细胞生长因子） 10～100 ng/mL，FGF
‑
10（成纤维细胞生长因子10） 10～100 ng/mL，B27 0.25x～1.5x，n
‑
Acetylcysteine（乙酰半胱氨酸） 1～2 mM，Nicotinamide（烟酰胺） 5～20 mM，Y
‑
27632 5～15 μM，β
‑
estradiol（β
‑
雌二醇） 50～200 nM，Heregulin beta
‑
1（Heregulin蛋白家族β1型蛋白）3～10 nM，所述条件培养基包括两种或三种蛋白条件培养基，其中所述蛋白条件培养基选自Wnt
‑
3a（Wnt蛋白家族3a型蛋白）条件培养基，R
‑
spondin1（R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白）条件培养基和Noggin（头蛋白）条件培养基；自源条件培养基是利用肿瘤相关成纤维细胞培养基对乳腺癌组织提取的自源肿瘤纤维细胞进行培养获得；且所述自源条件培养基中至少包括自源生长因子、自源白介素
因子、自源趋化因子，自源基质金属蛋白酶和其他自源因子；所述其他自源因子包括SDF1、VEGFA、TGFβ、PDGFα和PGE2。
[0007]在一些实施例中，所述乳腺癌类器官培养试剂组合，包括：酶解液和前述的乳腺癌类器官培养液；所述酶解液包括基础培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶和Primocin；其中，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1～2 mg/mL，所述Ⅲ型胶原酶的浓度为0.1～1 mg/mL，所述Primocin的浓度为0.2～2 mg/mL；所述乳腺癌类器官培养液与所述酶解液独立包装。
[0008]在一些实施例中，所述乳腺癌类器官的培养方法，包括：将乳腺癌样本进行物理预处理，得到样本组织碎块；将所述样本组织碎块进行酶解预处理，获得酶解混合液，将所述酶解混合液离心处理，获得细胞团块沉淀；采用基质胶重悬所述细胞团块沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后将所述凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养，使得所述凝胶凝固；向培养孔内加入前述的乳腺癌类器官培养液进行培养，获得原代乳腺癌类器官；将原代乳腺癌类器官进行传代培养，传代培养过程中采用前述的乳腺癌类器官培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为5～7天，获得相应代乳腺癌类器官。
[0009]本申请实施例提供的一种乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法，可以实现以下技术效果：本申请实施例提供的乳腺癌类器官培养液包括完全培养基和自源条件培养基，其中自源条件培养基中的多种分泌因子之间相互协同作用，同时该些分泌因子与完全培养基中的条件培养基、复合抗生素以及各生长因子之间相互协同作用，再配合复合抗生素的种类和浓度的控制，在防止污染的同时还能够保持细胞活性；而且加快了乳腺癌类器官细胞的形成和生长，保证了乳腺癌的培养成功率，成功率能够达到85%以上；而且提高培养速度，在传代培养过程中，培养5～7天即可达到传代要求；同时，自源条件培养基的加入，使得培养获得的乳腺癌类器官细胞更加仿生，可以体外维持体内的肿瘤特性，不会发生EMT转变，保持体内的间质特性。而且，进行多次传代获得的乳腺癌类器官与肿瘤组织样本的特征性蛋白marker表达具有一致性。
[0010]本申请实施例的乳腺癌器官培养液能够适用于人源乳腺癌类器官的培养，尤其适用于乳腺癌类器官的个性化培养，能够维持每一例病人原发组织的形体结构与病理特征。
[0011]本申请实施例提供的乳腺癌类器官培养试剂中，酶解液利用Ⅰ型胶原酶和Ⅲ型胶原酶协同进行酶解，能够缩短酶解时间，有效获得细胞或细胞团块且获得的细胞活性高，还可有效降低样本污染；然后利用本申请实施例的乳腺癌类器官培养液对乳腺癌肿瘤样本进行培养，能够加快乳腺癌类器官细胞的生长，提高培养速度。
[0012]本申请实施例提供的乳腺癌类器官的培养方法，操作简单，采用本申请实施例的乳腺癌类器官培养液能够有效缩减了原代类器官形成与生长时间，培养3天后即可见酶解后的单细胞与组织团块均形成类器官，并在培养5～7天后的乳腺癌类器官最大直径可达100 μm，可进行传代培养。在传代培养时，每代培养时间能够缩短至5～7天，传代培养5～7天后类器官的最大直径可达100 μm，即可进行传代，传代周期稳定缩短。同时，获得的乳腺癌类器官更加仿生，可以体外维持体内的肿瘤特性。同时，针对穿刺样本的培养成功率提高，达到85%以上。
[0013]以上的总体描述和下文中的描述仅是示例性和解释性的，不用于限制本申请。
附图说明
[0014]一个或多个实施例通过与之对应的附图进行示例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳腺癌类器官培养液，其特征在于，包括完全培养基和自源条件培养基，所述完全培养基与所述自源条件培养基的体积比为1～3﹕1；其中，所述完全培养基包括条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子；所述基础培养基包括优化后的杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F
‑
12，4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸5～15mM和Glutamax0.5x～1.5x；所述复合抗生素包括Primocin50～500μg/mL，青霉素
‑
链霉素0.5x～1.5x和甲硝唑2～10μg/mL；所述生长因子包括：表皮细胞生长因子10～100ng/mL，成纤维细胞生长因子1010～100ng/mL，B270.25x～1.5x，乙酰半胱氨酸1～2mM，烟酰胺5～20mM，Y
‑
276325～15μM，β
‑
雌二醇50～200nM，Heregulin蛋白家族β1型蛋白3～10nM，所述条件培养基包括两种或三种蛋白条件培养基，其中所述蛋白条件培养基选自Wnt蛋白家族3a型蛋白条件培养基，R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白条件培养基和头蛋白条件培养基；自源条件培养基是利用肿瘤相关成纤维细胞培养基对乳腺癌组织提取的自源肿瘤纤维细胞进行培养获得；且所述自源条件培养基中至少包括自源生长因子、自源白介素因子、自源趋化因子，自源基质金属蛋白酶和其他自源因子；所述其他自源因子包括SDF1、VEGFA、TGFβ、PDGFα和PGE2。2.根据权利要求1所述的乳腺癌类器官培养液，其特征在于，所述生长因子包括：所述生长因子包括：表皮细胞生长因子50ng/mL，成纤维细胞生长因子1050ng/mL，B270.75x～1x，乙酰半胱氨酸1.25～1.5mM，烟酰胺8～10mM，Y
‑
276328～10μM，β
‑
雌二醇150nM,Heregulin蛋白家族β1型蛋白5nM。3.根据权利要求1所述的乳腺癌类器官培养液，其特征在于，所述复合抗生素包括Primocin100μg/mL，青霉素
‑
链霉素1x和甲硝唑4μg/mL。4.根据权利要求1、2或3所述的乳腺癌类器官培养液，其特征在于，所述条件培养基包括Wnt蛋白家族3a型蛋白条件培养基，R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白条件培养基和头蛋白条件培养基；且所述Wnt蛋白家族3a型蛋白条件培养基、所述R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白条件培养基和所述头蛋白条件培养基的体积比依次为0.1～0.8﹕1～2﹕1；或者，所述条件培养基包括R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白条件培养基和头蛋白条件培养基；且所述R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白条件培养基和所述头蛋白条件培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖荣荣，李珮文，刘建闯，孙艳廷，张晓会，周宇，
申请(专利权)人：北京大橡科技有限公司，
类型：发明
国别省市：