肝癌模型细胞、体外培养方法、应用及肝癌动物模型建立方法技术

本申请公开了肝癌模型细胞、体外培养方法、应用及肝癌动物模型建立方法。该肝癌模型细胞按照WB表达检测计，以β

【技术实现步骤摘要】
肝癌模型细胞、体外培养方法、应用及肝癌动物模型建立方法


[0001]本申请涉及肝癌模型
，尤其涉及肝癌模型细胞、体外培养方法、应用及肝癌动物模型建立方法

技术介绍

[0002]在大量的肝癌肿瘤药物研究中，建立大鼠肝癌模型显得尤为重要。常用的大鼠肝癌模型建立分为移植型和原发性两种。
[0003]原发性肝癌模型是利用化学致癌物质诱发大鼠肝癌缓慢发生，这种模型虽然时间较长，但可以观察到肝癌发生发展的主要阶段，有利于肝癌早期瘤前病变的检测。目前国内外有很多用DEN诱发原发性大鼠肝癌的模型，。该模型主要存在的问题是染毒剂量不准确，时间较长。另外，以二乙基亚硝胺为启动剂，藻毒素为促进剂，构建大鼠肿瘤促进模型，观察肝脏病理形态改变，分别运用免疫组化法、原位杂交法检测肝细胞中GST
‑
Pi蛋白和GST
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Pi mRNA表达情况，然而其得到的动物模型肿瘤体积有限，肿瘤增强、黏附和侵袭能力一般，不利于对肿瘤细胞耐药性进行全面研究。
[0004]移植型肝癌模型通常是将肝癌细胞注射到小鼠腹腔，抽取腹水后分离成细胞悬液，再打开小鼠腹腔并将细胞悬液注射到小鼠肝脏建立模型。然而，现有的移植型模型成瘤时间较短，但无法观察到肝癌发生的过程，也得到模型动物肿瘤增强、黏附和侵袭能力一般，也不利于对肿瘤细胞耐药性进行全面研究。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本申请的目的在于提取一种肝癌模型细胞、体外培养方法、模型建立方法及应用，以一定程度上解决上述技术问题之一。
[0006]第一方面，本申请实施例公开了一种大鼠肝癌模型细胞的体外培养方法，包括以下步骤：
[0007]获得大鼠肝癌细胞系RH
‑
35细胞；
[0008]制备明胶/聚乳酸/透明质酸的混合液，所述混合液是以20～100mg/mL的明胶溶液、2～15mg/mL透明质酸溶液和10～50mg/mL聚乳酸溶液按照1:(1～4):1的比例混合而成；
[0009]三维培养，将所述RH
‑
35细胞接种至明胶/聚乳酸/透明质酸组成三维介质和3D培养混合液中培养7～15天，即得。
[0010]在本申请实施例中，所述三维培养方法具体包括：
[0011]第一培养，将所述RH
‑
35细胞接种至未成凝胶的明胶/聚乳酸/透明质酸混合液和3D培养混合液的培养体系中，浸润后观察细胞在培养皿中生长至70％～80％；及
[0012]第二培养，收获所述第一培养中得到的细胞，清洗，消化，浓缩后，转移至铺设有明胶/聚乳酸/透明质酸成型的三维培养水凝胶支架和3D培养混合液的环境中培养，培养7～15天，即得。
[0013]在本申请实施例中，所述3D培养混合液为包含全氟辛酸或全氟辛烷磺酸钾的高糖
DMEM培养液。
[0014]在本申请实施例中，所述3D培养混合液包含0.3～10mg/L全氟辛酸或0.3～10mg/L全氟辛烷磺酸钾。
[0015]在本申请实施例中，所述高糖DMEM培养液包含116.6mg/L无水氯化钙、59.05mg/L L
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亮氨酸亚油酸、0.042mg/L亚油酸、0.0013mg/L五水硫酸铜、91.25mg/L L
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赖氨酸盐酸盐、0.105mg/L硫辛酸、0.05mg/L九水硝酸铁、17.24mg/L L
‑
蛋氨酸、8.1mg/L酚红、0.417mg/L七水硫酸亚铁、35.48mg/L L
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苯丙氨酸、0.081mg/L 1,4
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丁二胺二盐酸盐、311.8mg/L氯化钾、26.25mg/L L
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丝氨酸、55mg/L丙酮酸钠、28.64mg/L氯化镁、53.45mg/L L
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苏氨酸、0.0035mg/L维生素H、48.84mg/L无水硫酸镁、4.45mg/L L
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丙氨酸、2.24mg/LD
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泛酸钙、6999.5mg/L氯化钠、7.5mg/L L
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天门冬酰胺、氯化胆碱8.98mg/L、54.35mg/L无水磷酸二氢钠、6.65mg/L L
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天门冬氨酸、2.65mg/L叶酸、71.02mg/L磷酸氢二钠、17.56mg/L L
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半胱氨酸盐酸盐、12.6mg/L i
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肌醇、0.432mg/L七水硫酸锌、7.35mg/L L
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谷氨酸、2.02mg/L烟酰胺、147.5mg/L L
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精氨酸盐酸盐、17.25mg/L L
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脯氨酸、2mg/L盐酸吡哆醛、31.29mg/L L
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胱氨酸盐酸盐、9.02mg/L L
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色氨酸、0.031mg/L盐酸吡哆醇、365mg/L L
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谷氨酰胺、38.4mg/L L
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酪氨酸、0.219mg/L核黄素、18.75mg/L甘氨酸、52.85mg/L L
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缬氨酸、2.17mg/L盐酸硫胺、31.48mg/L L
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组氨酸盐酸盐、3151mg/L D
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葡萄糖、0.365mg/L胸苷、54.47mg/L L
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异亮氨酸、2mg/L次黄嘌呤和0.68mg/L维生素B12。
[0016]第二方面，本申请实施例公开了第一方面所述的体外培养方法得到肝癌模型细胞，所述细胞按照WB表达检测计，以β
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actin为参照，HAb18G/CD147的相对表达量为3.6～6.07，paxillin的相对表达量为4.39～6.97，FAK的相对表达量为1.85～3.17。
[0017]第三方面，本申请实施例公开了用于建立肝癌模型的的细胞制剂，所述细胞制剂为细胞冻存管、冻存液或冻干粉，所述细胞制剂包含权利要求6所述的肝癌模型细胞。
[0018]第四方面，本申请实施例公开了一种建立肝癌动物模型的方法，将第二方面所述的肝癌模型细胞或第三方面所述的细胞制剂注射待建立模型的动物，观察动物体内肿瘤体积的变化情况。
[0019]第五方面，本申请实施例公开了第一方面所述的体外培养方法得到的肝癌模型细胞在建立肝癌动物模型中的应用。
[0020]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0021]本申请利用大鼠肝癌细胞系RH
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35作为基础，将其与体外进行传代培养，并将其在配制的明胶/聚乳酸/透明质酸三维介质和高糖培养液中培养，使得培养的细胞具有丝状伪足，并在三维水凝胶接种中形成缠绕的三维细胞团，接近于体外的三维细胞及微环境。经过间接免疫荧光检测发现其关键黏附因子(paxillin,FAK和p
‑
FAK)的表达均明显上调。
[0022]另外，本申请还通过体内试验，将各组实施例和对比例培养的RH...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大鼠肝癌模型细胞的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：获得大鼠肝癌细胞系RH
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35细胞；制备明胶/聚乳酸/透明质酸的混合液，所述混合液是以20～100mg/mL的明胶溶液、2～15mg/mL透明质酸溶液和10～50mg/mL聚乳酸溶液按照1:(1～4):1的比例混合而成；三维培养，将所述RH
‑
35细胞接种至明胶/聚乳酸/透明质酸组成三维介质和3D培养混合液中培养7～15天，即得。2.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述三维培养方法具体包括：第一培养，将所述RH
‑
35细胞接种至未成凝胶的明胶/聚乳酸/透明质酸混合液和3D培养混合液的培养体系中，浸润后观察细胞在培养皿中生长至70％～80％；及第二培养，收获所述第一培养中得到的细胞，清洗，消化，浓缩后，转移至铺设有明胶/聚乳酸/透明质酸成型的三维培养水凝胶支架和3D培养混合液的环境中培养，培养7～15天，即得。3.根据权利要求2所述的体外培养方法，其特征在于，所述3D培养混合液为包含全氟辛酸或全氟辛烷磺酸钾的高糖DMEM培养液。4.根据权利要求3所述的体外培养方法，其特征在于，所述3D培养混合液包含0.3～10mg/L全氟辛酸或0.3～10mg/L全氟辛烷磺酸钾。5.根据权利要求3所述的体外培养方法，其特征在于，所述高糖DMEM培养液包含116.6mg/L无水氯化钙、59.05mg/L L
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亮氨酸亚油酸、0.042mg/L亚油酸、0.0013mg/L五水硫酸铜、91.25mg/L L
‑
赖氨酸盐酸盐、0.105mg/L硫辛酸、0.05mg/L九水硝酸铁、17.24mg/L L
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蛋氨酸、8.1mg/L酚红、0.417mg/L七水硫酸亚铁、35.48mg/L L
‑
苯丙氨酸、0.081mg/L 1,4
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丁二胺二盐酸盐、311.8mg/L氯化钾、26.25mg/L L
‑
丝氨酸、55mg/L丙酮酸钠、28.64mg/L氯化镁、53.45mg/L L
‑
苏氨酸、0.0035mg/L维生素H、48.84mg/L无水硫酸镁、4.45mg/L L
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丙...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐博，赖世辉，刘晓萌，王洪权，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：