肠癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法技术

本申请涉及生物组织工程技术领域，公开一种肠癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法，所述肠癌类器官培养液包括条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子。其中，复合抗生素包括Primocin，青霉素

【技术实现步骤摘要】
肠癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法


[0001]本申请涉及生物组织工程
，例如涉及一种肠癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法。

技术介绍

[0002]肠癌，包括结肠癌和直肠癌，是我国的十大恶性肿瘤之一。目前，肠癌的病因尚未完全清楚，目前认为主要是环境因素与遗传因素综合作用的结果。肠癌类器官，例如，结直肠癌类器官，是研究肠癌的优势模型。目前虽有一些肠癌类器官培养基的研究报道，但是其培养过程生长慢，增加时间投入成本。
[0003]在研发过程中，发现相关技术中至少存在如下问题：现有肠癌类器官的培养过程中，每次传代至少需要培养7天，甚至更多天，才达到传代要求。而且，获得的细胞量也非常少，为了收获更多的细胞，进行下游试验，需要时间更长，使得整个器官的构建过程缓慢，导致肠癌类器官研究的时间成本高。

技术实现思路

[0004]为了对披露的实施例的一些方面有基本的理解，下面给出了简单的概括。所述概括不是泛泛评述，也不是要确定关键／重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围，而是作为后面的详细说明的序言。
[0005]本申请实施例提供一种肠癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法，以加快肠癌类器官细胞的生长，提高培养速度。
[0006]在一些实施例中，所述肠癌类器官培养液，包括，条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子；所述条件培养基与所述基础培养基的体积比为1～4﹕1；所述基础培养基包括Advanced DMEM/F12（优化后的杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F
‑<br/>12），HEPES（4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸） 5～15 mM和Glutamax 0.5x～1.5x；所述复合抗生素包括Primocin 50～500 μg/mL，青霉素
‑
链霉素0.5x～1.5x和甲硝唑2～10 μg/mL；所述生长因子包括：EGF（表皮细胞生长因子） 10～100 ng/mL，FGF
‑
10（成纤维细胞生长因子10） 10～100 ng/mL，N2 0.25x～1.5x，B27 0.25x～1.5x，n
‑
Acetylcysteine（乙酰半胱氨酸） 1～2 mM，Nicotinamide （烟酰胺）5～20 mM，Gastrin 5～20 nM，Prostaglandin E2 0.2～2 μM，Y
‑
27632 5～15 μM，HGF 10～50 ng/μL，IL
‑
6 5～40 ng/μL，SDF1 3～30 ng/μL；所述条件培养基包括两种或三种蛋白条件培养基，其中所述蛋白条件培养基选自Wnt
‑
3a（Wnt蛋白家族3a型蛋白）条件培养基，R
‑
spondin1（R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白）、R
‑
spondin3条件培养基和头蛋白条件培养基。
[0007]在一些实施例中，所述肠癌类器官培养试剂组合，包括：酶解液和前述的肠癌类器官培养液；所述酶解液包括基础培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶和Primocin；其中，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1～2 mg/mL，所述Ⅲ型胶原酶的浓度为0.1～1 mg/mL，所述Primocin的浓度为0.2～2 mg/mL；所述肠癌类器官培养液与所述酶解液独立包装。
[0008]在一些实施例中，所述肠癌类器官的培养方法，包括：将肠样本进行物理预处理，得到样本组织碎块；将所述样本组织碎块进行酶解预处理，过滤获得滤过液，将所述滤过液离心处理，获得细胞沉淀；采用基质胶重悬所述细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后将所述凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养，使得所述凝胶凝固；向培养孔内加入前述的肠癌类器官培养液进行培养，获得原代肠癌类器官；将原代肠癌类器官进行传代培养，传代培养过程中采用前述的肠癌类器官培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为3～5天，获得相应代肠癌类器官。
[0009]本申请实施例提供的一种肠癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法，可以实现以下技术效果：本申请实施例提供的肠癌类器官培养液各物质之间相互协同作用，其中，基质衍生因子
‑
1（Stromal Derived Factor
‑
1，SDF
‑
1）刺激癌细胞增殖，并可通过招募内皮前体细胞增加肿瘤血管生成；HGF 可通过HGF/c
‑
Met/STAT3/Twist1通路促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；IL
‑
6可通过IL
‑
6/IL
‑
6R/JAK2/STAT3/Twist1通路发生相同促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭的作用，IL
‑
6还可以上调c
‑
Met的表达，进而与HGF在增强CAF（肿瘤相关成纤维细胞）的特性方面存在协同作用；以及复合抗生素的种类和浓度的控制，在防止污染的同时还能够保持细胞活性；综上，通过在培养基中增加以上细胞因子而产生的相互协同作用，配合复合抗生素，加快了肠癌类器官细胞的形成和生长，提高培养速度，在传代培养过程中，培养3
‑
4天即可达到传代要求。本申请实施例的培养液能够适用于人源肠癌类器官的培养，例如，小肠癌、直肠癌、结肠癌等，在培养过程中，能够维持原发组织的形体结构与病理特征。而且，进行多次传代获得的肠癌类器官与肿瘤组织的特征性蛋白marker表达具有一致性。
[0010]本申请实施例提供的肠癌类器官培养试剂中，酶解液利用Ⅰ型胶原酶和Ⅲ型胶原酶进行酶解，能够缩短酶解时间，获得的细胞活性高，还可有效降低样本污染；然后利用本申请实施例的肠癌类器官培养液对肠癌肿瘤样本进行培养，能够加快肠癌类器官细胞的生长，提高培养速度。
[0011]本申请实施例提供的肠癌类器官的培养方法，操作简单，采用本申请实施例的肠癌类器官培养液能够有效缩减了原代类器官形成与生长时间，在传代培养时，每代培养时间能够缩短至3天。在传代培养过程中，培养3天类器官直径可达80～110 μm，5天可达200μm，传代周期稳定缩短。而且，在采用肠癌类器官培养试剂进行原代提取培养过程中，培养24 h后即可见大量结直肠癌类器官形成，最大直径达200 μm以上。
[0012]以上的总体描述和下文中的描述仅是示例性和解释性的，不用于限制本申请。
附图说明
[0013]一个或多个实施例通过与之对应的附图进行示例性说明，这些示例性说明和附图并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件示为类似的元件，附图不构成比例限制，并且其中：图1是本申请实施例的一种肠癌类器官培养方法的原代培养24 h后的肠癌类器官的光镜图；图2是本申请实施例的另一种肠癌类器官培养方法的原代培养24 h后的肠癌类器
官的光镜图；图3是本申请实施例的另一种肠癌类器官培养方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠癌类器官培养液，其特征在于，包括条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子；所述条件培养基与所述基础培养基的体积比为1～4﹕1；所述基础培养基包括优化后的杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F
‑
12，4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸5～15mM和Glutamax0.5x～1.5x；所述复合抗生素包括Primocin50～500μg/mL，青霉素
‑
链霉素0.5x～1.5x和甲硝唑2～10μg/mL；所述生长因子包括：表皮细胞生长因子10～100ng/mL，成纤维细胞生长因子1010～100ng/mL，N20.25x～1.5x，B270.25x～1.5x，乙酰半胱氨酸1～2mM，烟酰胺5～20mM，Gastrin5～20nM，ProstaglandinE20.2～2μM，Y
‑
276325～15μM，HGF10～50ng/μL，IL
‑
65～40ng/μL，SDF13～30ng/μL；所述条件培养基包括两种或三种蛋白条件培养基，其中所述蛋白条件培养基选自Wnt蛋白家族3a型蛋白条件培养基，R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白、R
‑
spondin3条件培养基和头蛋白条件培养基。2.根据权利要求1所述的肠癌类器官培养液，其特征在于，所述生长因子包括：表皮细胞生长因子50ng/mL，成纤维细胞生长因子1050ng/mL，N20.75x～1x，B270.75x～1x，乙酰半胱氨酸1.25～1.5mM，烟酰胺8～10mM，Gastrin8～10nM，ProstaglandinE20.5～1μM，Y
‑
276328～10μM，HGF20～30ng/μL，IL
‑
610～20ng/μL，SDF15～10ng/μL。3.根据权利要求1所述的肠癌类器官培养液，其特征在于，所所述复合抗生素包括Primocin100μg/mL，青霉素
‑
链霉素1x和甲硝唑4μg/mL。4.根据权利要求1、2或3所述的肠癌类器官培养液，其特征在于，所述条件培养基包括Wnt蛋白家族3a型蛋白条件培养基，R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白、R
‑
spondin3条件培养基和头蛋白条件培养基；且所述Wnt蛋白家族3a型蛋白条件培养基、所述R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白、R
‑
spondin3条件培养基和所述头蛋白条件培养基的体积比依次为0.1～0.8﹕1～2﹕1；或者，所述条件培养基包括R
‑
spondin蛋白家族1型蛋白、R
‑
spondin3条件培养基和头蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖荣荣，李珮文，刘建闯，孙艳廷，张晓会，周宇，
申请(专利权)人：北京大橡科技有限公司，
类型：发明
国别省市：