一种可视化混合染料及其在LAMP检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种可视化混合染料及其在LAMP检测中的应用，可视化混合染料包括试剂A和试剂B，试剂A和试剂B体积比为1:1

【技术实现步骤摘要】
一种可视化混合染料及其在LAMP检测中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种可视化混合染料及其在LAMP检测中的应用。

技术介绍

[0002]环介导等温扩增技术(loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)是一种近年来发展较快的核酸恒温扩增技术。它能够在恒定温度下对靶基因序列进行扩增，进而实现目的基因的快速检测，因其时间短、灵敏度高、特异性好和操作便捷等优点受到越来越多的关注。目前，LAMP结果的读取主要分为浊度检测、琼脂糖凝胶电泳检测和荧光/可视化染料检测等3类方法。但由于浊度检测和电泳检测都依赖于仪器并需要较复杂操作，因而可视化染料检测方法越来越受到专家学者的青睐。该方法只需在LAMP反应开始前于反应体系中加入染料，反应后，阴性反应试剂和阳性反应试剂即会呈现出明显的颜色差异，从而实现反应结果的快速判读。
[0003]目前，应用比较广泛的染料由以下两种：1)羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol Blue，HNB)，HNB作为金属离子指示剂，深紫色粉末，易溶于水和乙醇，也可作为LAMP反应可视化指示剂。在LAMP体系中提前加入HNB水溶液，起初镁离子与HNB结合使得反应液为紫色，随着反应的进行，Mg
2+
与析出的P2O
74
‑
反应生成Mg2P2O7沉淀，HNB失去Mg
2+
使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持紫罗兰色；2)钙黄绿素(Calcein)，亮黄色粉末，溶于乙醇和碱，微溶于水，荧光指示剂，与Mg
2+
结合而成的复合物可产生强烈荧光，自然光下阴性、阳性结果间存在一定差异，但并不明显。首先在钙黄绿素中加入Mn
2+
，Mn
2+
使钙黄绿素的绿色荧光淬灭。当LAMP扩增反应发生后，产生的副产物焦磷酸离子与Mn
2+
结合并释放钙黄绿素，淬灭状态解除。最终呈现的结果为在365nm蓝光激发下，阳性反应发出强绿色荧光，阴性反应发出较弱绿色荧光。
[0004]上述两种染料通常被单独使用，但是它们存在一个极大的弊端，就是阴性和阳性结果之间颜色差异不够明显，或者需要仪器辅助判读结果，过程复杂。尤其是在自然光下，当目标基因浓度过低时，弱阳性结果与阴性结果难以区分，从而导致结果判读不准确。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种可视化混合染料及其在LAMP检测中的应用。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：一种可视化混合染料，包括试剂A和试剂B，试剂A和试剂B体积比为1：2；
[0007]试剂A中含有钙黄绿素和氯化锰，钙黄绿素的浓度为500μM，氯化锰浓度为10mM；
[0008]试剂B中含有羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝浓度为0.32mM。
[0009]优选地，试剂A和/或试剂B由去核酸酶水制备得到。
[0010]可视化混合染料在LAMP检测中的应用。
[0011]优选地，在LAMP反应前预先加入到LAMP反应体系中。
[0012]优选地，LAMP扩增前，反应体系呈灰蓝色；
[0013]LAMP扩增结束后，阳性反应体系为天蓝色，阴性反应体系为紫罗兰色。
[0014]本专利技术具有的优点和积极效果是：与目前常见可视化染料相比，本方案所公开的可视化混合染料使LAMP反应结果更容易判断，阴性和阳性结果间颜色差异更加明显，极大程度避免了结果的判断，而且不需要复杂的仪器设备来辅助检测实验结果；
[0015]另外，该可视化混合染料预先添加与LAMP反应体系中，在LAMP反应后，不必再打开PCR管盖，避免了对实验室环境造成核酸污染；
[0016]该可视化混合染料为非DNA嵌入型染料，对LAMP反应干扰小，不影响LAMP检测的灵敏度与特异性。
附图说明
[0017]图1是本专利技术实施例LAMP扩增前新型混合染料显色；
[0018]图2是本专利技术实施例LAMP扩增后新型混合染料显色；
[0019]图3是本专利技术实施例核酸电泳图；
[0020]图4是本专利技术对比例LAMP扩增前显色情况；
[0021]图5是本专利技术对比例LAMP扩增后显色情况；
[0022]1：106copies/μL，2：105copies/μL，3：104copies/μL，4：103copies/μL，5：102copies/μL，6：101copies/μL，7：1copies/μL，8：NTC。
具体实施方式
[0023]下面结合附图对本专利技术的实施例做出说明。
[0024]本专利技术公开一种可视化混合染料，包括试剂A和试剂B，试剂A和试剂B体积比为1：2；试剂A中含有钙黄绿素和氯化锰，用去核酸酶水溶解，钙黄绿素的浓度为500μM，氯化锰浓度为10mM；试剂B中含有羟基萘酚蓝，用去核酸酶水溶解，羟基萘酚蓝浓度为0.32mM。这种可视化混合染料能够应用在LAMP检测中，在LAMP反应前预先加入到LAMP反应体系中，反应结束后，可根据体系颜色直接判断阳性阴性，且颜色对比差异明显；LAMP扩增前，反应体系呈灰蓝色；LAMP扩增结束后，阳性反应体系为天蓝色，阴性反应体系为紫罗兰色。
[0025]下面结合附图对本专利技术方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
[0026]实施例1：
[0027]1.1可视化混合染料的制备
[0028]称取钙黄绿素粉末与氯化锰粉末置于同一容器内，用去核酸酶水溶解，使溶液中钙黄绿素浓度为500μM，氯化锰浓度为10mM，调节PH值至弱碱性，充分混匀，获得溶液为试剂A，即单一钙黄绿素储存液，4℃保存待用。
[0029]称取HNB粉末，用去核酸酶水溶解，使溶液中HNB的浓度为0.32mM，充分混匀，所得到的溶液为试剂B，即单一HNB染料储存液，4℃保存待用。
[0030]将试剂A和试剂B按照1:2体积充分混匀，获得的溶液即为可视化混合染料，4℃保
存待用。
[0031]1.2可视化混合染料用于LAMP扩增反应
[0032]按照下表配置LAMP反应体系。
[0033][0034][0035]KPC特征序列：
[0036]CTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTAAACTCGAACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCGCAACTGTAAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTCTTGCTGCCGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCCGTTACGGCAAAAATGCGCTGGTT...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可视化混合染料，其特征在于：包括试剂A和试剂B，试剂A和试剂B体积比为1：2；试剂A中含有钙黄绿素和氯化锰，钙黄绿素的浓度为500μM，氯化锰浓度为10mM；试剂B中含有羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝浓度为0.32mM。2.根据权利要求1所述的可视化混合染料，其特征在于：试剂A和/或试剂B由去核酸酶水制备得到。3.权利要求1或2所述的可视...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏斌，熊冬生，董恒，陈晓玲，王思怡，王兴，臧丹戎，
申请(专利权)人：天津喜诺生物医药有限公司天津一瑞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：