一种玉足海参的SSR标记及其扩增引物、检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种玉足海参的SSR标记及其扩增引物、检测方法和应用，属于分子标记技术领域。本发明专利技术利用二代基因组测序获得的玉足海参序列，开发获得26个具有高度多态性的玉足海参SSR标记，并提供针对上述SSR标记的扩增引物、检测方法。本发明专利技术的玉足海参SSR标记及其扩增引物可用于玉足海参遗传多样性分析、亲子鉴定和放流海参溯源，为玉足海参遗传多样性研究、增养殖和增殖放流奠定基础。究、增养殖和增殖放流奠定基础。究、增养殖和增殖放流奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种玉足海参的SSR标记及其扩增引物、检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及到分子标记
，具体涉及一种玉足海参的SSR标记及其扩增引物、检测方法和应用。

技术介绍

[0002]玉足海参(Holothuria leucospilota)隶属于楯手目(Aspidochirotida)、海参科(Holothuriidae)、海参属(Holothuria)，广泛分布于印度——西太平洋海域，在我国主要分布于福建南部、台湾、广东、广西、海南岛和西沙群岛。玉足海参不仅具有较高的药用价值，在缓冲CO2过量造成的海洋酸化及海洋生态系统修复中也发挥着非常重要的作用。近年来，由于过度捕捞，自然海域海参资源遭到严重破坏，引起珊瑚礁的净化功能受损，进而导致珊瑚礁海域生态系统功能退化。为了恢复珊瑚礁生态系统的平衡，迫切需要进行海参的人工养殖和增殖放流。玉足海参作为珊瑚礁生态系统的“卫士”，其人工增养殖和增殖放流显得尤为重要。
[0003]种质资源是发展增养殖的物质基础，种质资源评价的数据对于在人工繁育过程中保持经济种类的遗传多样性和避免近交衰退具有重要意义，对增养殖的成败和增养殖产业的可持续发展起关键作用。由于微卫星(microsatellite，又称简单重复序列simple sequence repeats,SSRs)具有杂合程度高、多态性丰富、重复性好、共显性遗传等优点，已广泛应用于种群多样性的评估中。迄今为止，尚未开展玉足海参SSR标记的开发工作，本研究希望通过高度多态性SSR标记的开发为玉足海参遗传多样性的研究奠定基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供玉足海参SSR标记及其扩增引物、检测方法和应用，为玉足海参遗传多样性分析提供高度多态性的分子标记。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术对采自深圳大亚湾和海南潭门港的玉足海参各三条进行二代基因组测序(Illumina HiSeq Xten)，将获得的序列通过MISA(MIcroSAtellite identification tool)软件查找SSR位点，利用自编程序将具有地理差异的SSR位点筛选出来，共获得261个SSR位点。采用Primer Premier 5软件，共设计了261对引物，对玉足海参的基因组DNA进行PCR扩增，其中有82对引物能稳定扩增出目的条带。采用筛选出的82对引物对来自深圳大亚湾、湛江硇洲岛和北海涠洲岛各11头海参的DNA进行扩增，采用3730XL测序仪对PCR扩增产物进行分型，并利用GeneMapper 3.2软件读取等位基因片段的长度，用Cervus 3.0软件对多态性信息进行分析，最终确定了26个具有高度多态性的玉足海参SSR标记。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种玉足海参的SSR标记，包括以下的一组或多组：
[0007][0008][0009]本专利技术的第二个目的是提供一种鉴定上述SSR标记的扩增引物，包括以下的一组或多组：
[0010][0011][0012][0013]优选，所述的扩增引物的正向引物的5
’
端标记有荧光基团；所述的荧光基团包括但不限于ROX、FAM、HEX、TAMRA。
[0014]本专利技术的第三个目的是提供一种玉足海参的检测试剂盒，包括上述的扩增引物。
[0015]优选，所述的快速检测试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶和ddH2O。
[0016]本专利技术的第四个目的是提供一种玉足海参SSR标记的检测方法，包括以下步骤：
[0017](1)提取玉足海参基因组DNA；
[0018](2)以步骤(1)提取到的基因组DNA为模板，利用权利要求2、3或4所述的扩增引物进行PCR扩增；
[0019](3)利用测序仪对PCR扩增产物进行分型。
[0020]优选，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应体系25μL，包括：不含Mg
2+
的10
×
PCRbuffer2.5μL、25mM MgCl22.0μL、10mM dNTPs 0.5μL、高保真PCR酶1U、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL。
[0021]优选，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
[0022]本专利技术的第五个目的是提供上述的SSR标记、扩增引物或检测试剂盒在玉足海参群体遗传多样性分析、亲子鉴定或放流海参溯源中的应用。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术开发获得的26个具有高度多态性的玉足海参SSR标记，编号分别为H25、H33、H45、H46、H57、H68、H69、H87、H88、H94、H104、H106、H117、H140、H141、H142、H144、H146、H150、H171、H172、H184、H190、H200、H206和H215，可用于玉足海参遗传多样性分析、亲子鉴定和放流海参溯源，为玉足海参遗传多样性研究、增养殖和增殖放流奠定基础。
附图说明
[0024]图1是来源于3个群体的玉足海参的聚类图。
[0025]图2是来源于3个群体的玉足海参Delta K值趋势图。
[0026]图3是基于贝叶斯模型的玉足海参个体在三个群组上的分配图。
具体实施方式
[0027]以下结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。
[0028]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。引物合成和测序由上海生物工程有限公司完成。
[0029]实施例1玉足海参26个微卫星位点的多态性分析
[0030]1、玉足海参具有地理差异的SSR位点的筛选
[0031]对采自深圳大亚湾和海南潭门港的玉足海参各三条进行二代基因组测序(Illumina HiSeq Xten)，将获得的序列通过MISA(MIcroSAtellite identification tool)软件查找SSR位点，利用自编程序将具有地理差异的SSR位点筛选出来，共获得261个SSR位点。
[0032]2、玉足海参基因组DNA的提取
[0033]选取来自于深圳大亚湾(样品S1
‑
S11)、湛江硇洲岛(样品S12
‑
S22)和北海涠洲岛(样品S23
‑
S33)各11头海参，分别取肌肉组织，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取玉足海参基因组DNA，操作步骤严格按照说明书进行。基因组DNA定量采用NanoDrop
TM 2000分光光度计完成，质量采用琼脂糖电泳来检测。
[0034]3、多态性引物的筛选及结果分析
[0035]根据已获得的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玉足海参的SSR标记，其特征在于，所述的SSR标记包括以下的一组或多组：H25、H33、H45、H46、H57、H68、H69、H87、H88、H94、H104、H106、H117、H140、H141、H142、H144、H146、H150、H171、H172、H184、H190、H200、H206和H215；所述的H25的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的H33的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的H45的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的H46的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的H57的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述的H68的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的H69的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述的H87的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述的H88的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述的H94的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述的H104的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的H106的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述的H117的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述的H140的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述的H141的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述的H142的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述的H144的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述的H146的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述的H150的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述的H171的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述的H172的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述的H184的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；所述的H190的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述的H200的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述的H206的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；所述的H215的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。2.一种鉴定权利要求1所述的SSR标记的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物包括以下的一组或多组：针对H25位点：F：5
’‑
ATATGGCAGTGTCTTCATG
‑3’
；R：5
’‑
AGAGTTCCGCCCAGTTT
‑3’
；针对H33位点：F：5
’‑
TCGGCATTTACAGAGTG
‑3’
；R：5
’‑
AACCTGAGCCAGTTCCT
‑3’
；针对H45位点：F：5
’‑
TGGAAGAGGTGGCAGAT
‑3’
；
R：5
’‑
GCATCGTGGTGCTACATT
‑3’
；针对H46位点：F：5
’‑
CGGATGAGGCATAATAAC
‑3’
；R：5
’‑
GGGCAACAAGTGGGTAG
‑3’
；针对H57位点：F：5
’‑
GAAATGGCATCAAGAATC
‑3’
；R：5
’‑
GAAAGACCCTGGAAAGA
‑3’
；针对H68位点：F：5
’‑
ATGCCATTCCATTTGCT
‑3’
；R：5
’‑
CAGCCAAAGATGTACCAGAA
‑3’
；针对H69位点：F：5
’‑
AAACCGCCCACCACCTT
‑3’
；R：5
’‑
CAAGCATTCCCAAGTGA
‑3’
；针对H87位点：F：5
’‑
ATGCCATCAGACCTTAG
‑3’
；R：5
’‑
GCCAATAAGACCCATAC
‑3’
；针对H88位点：F：5
’‑
GTACGAAAGAAAGGGAGC
‑3’
；R：5
’‑
ACCTTGCCTTCAGACATA
‑3’
；针对H94位点：F：5
’‑
TCATTGCGCCCATCTTT
‑3’
；R：5
’‑
AACAGCAGTTAAAGCATTCTCAA
‑3’
；针对H104位点：F：5
’‑
TGACCTACAGTACATGCGAAGT
‑3’
；R：5
’‑
GCGGACGATTTGTCAAGGTAG
‑3’
；针对H106位点：F：5
’‑
AGAGTAAATCAGTCGAAAGT
‑3’
；R：5
’‑
ATGCCTTAGATAACACCA
‑3’
；针对H117位点：F：5

【专利技术属性】
技术研发人员：任春华，孙红岩，杨韵，李小敏，江晓，陈廷，罗鹏，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：