含有CAR核酸片段的表达质粒、含该表达质粒的靶向CD105的CAR-T细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种含有CAR核酸片段的表达质粒，所述CAR核酸片段为嵌合抗原受体CD105 Nb

【技术实现步骤摘要】
含有CAR核酸片段的表达质粒、含该表达质粒的靶向CD105的CAR-T细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于肿瘤生物制品领域，具体涉及含有CAR核酸片段的表达质粒、含该表达质粒的靶向CD105的CAR-T细胞及其制备方法和在例如过继免疫治疗中的应用。

技术介绍

[0002]近年来免疫治疗已逐渐成为肿瘤治疗领域的焦点，其中免疫细胞过继治疗成为研究的热点，基于嵌合抗原受体修饰T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR T)的免疫疗法已经证明是一种有希望的癌症治疗策略。嵌合抗原受体T细胞通过提取患者体内的T细胞，利用基因工程技术使识别肿瘤特异性抗原的受体表达在T细胞表面，T细胞绕过抗原提呈阶段以及MHC(major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体)的限制，特异性识别和攻击杀伤肿瘤细胞。由于是诱导、激活自体细胞，因此该疗法没有放疗和化疗的毒副反应。
[0003]CAR-T细胞是由抗原识别结构域(配体或单链抗体scFv)、铰链区、跨膜区和胞内信号区连接而成。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性都是关键的决定因素。CD105，又称Endoglin，是血管内皮细胞增殖相关膜抗原，被认为是新生血管内皮细胞的特异标志分子之一，表达于实体肿瘤新生血管及相关肿瘤细胞表面，与某些癌症的预后密切相关，表明CD105可作为有吸引力的血管内皮靶标。CAR-T细胞的胞外抗原识别区通常为单链可变片段(single chain variable fragment,scFv)，由重链可变片段通过柔性连接轻链可变片段组成。然而scFv并不总是有效折叠，并倾向于聚集。纳米抗体(Nanobody，Nb)由重链的可变区(variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHH)构成，体积小(宽2.5nm，长4.2nm)，分子量小(约为15KDa)，可以快速扩散至全身，并且具有良好的组织穿透能力。Nanobody基因序列与人VH基因家族3序列具有高度同源性，所以在人体内的免疫原性低。因此Nanobody可以作为产生肿瘤抗原特异性CAR-T细胞的理想抗原识别区域。CAR-T的制备大多采用慢病毒转染，易产生插入突变等问题。CRISPR/Cas 9技术是备受关注的一项新兴基因编辑技术，CRISPR/Cas 9系统由非特异性的Cas 9蛋白和一系列具有片段特异性的CrRNA(CRISPR RNA)组成，这些CrRNA能够在靶向位置引导Cas 9剪切DNA并产生双链断裂，然后细胞会借助同源重组机制或者非同源末端连接机制对断裂的DNA进行修复，产生所需要的基因的定点插入、删除或者靶向位置的基因替换。
[0004]恶性肿瘤已成为目前危害人类身体健康最严重的疾病之一，肿瘤传统治疗手段有手术、化疗和放疗，传统方法虽然能使病情缓解，但存在肿瘤复发率高、化疗耐药以及严重影响生活质量等问题。近年来综合治疗提高了肿瘤的治疗效果，但仍相当一部分患者复发或对常规治疗产生耐药，为此我们提出了含有CAR核酸片段的表达质粒、含有该表达质粒的一种CD105靶向性CAR-T细胞及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中的一个或多个技术问题，本专利技术在第一方面提供了一种含有CAR核酸片段的表达质粒，所述CAR核酸片段为嵌合抗原受体CD105VHH-CD8-CD137-CD3ζ片段，由CD105 VHH、CD8铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。
[0006]本专利技术在第二方面提供了一种工程化CD105靶向性CAR-T细胞，所述CAR-T细胞转染有本专利技术第一方面所述的表达质粒。
[0007]本专利技术在第三方面提供了一种用于制备本专利技术第二方面所述的CAR-T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008](1)制备本专利技术第一方面所述的表达质粒；
[0009](2)将所述表达载体转染到T细胞中，从而获得CAR-T细胞的方法。
[0010]本专利技术在第四方面提供了本专利技术第一方面所述的表达质粒在制备本专利技术第二方面所述的CAR-T细胞中的应用。
[0011]本专利技术在第五方面提供了本专利技术第二方面所述的CAR-T细胞在制备用于治疗肿瘤制剂中的应用。
[0012]本专利技术的研究者发现于，对CD105阳性肿瘤免疫治疗中，CD105 CAR-T的优势在于特异性的靶向，增强免疫细胞靶向识别肿瘤抗原，嵌合抗原受体依赖的肿瘤杀伤活性以及输注后在肿瘤部位的浸润。CD105 CAR-T细胞所拥有的这些特性源于嵌合抗原受体的功能结构，主要包含抗原识别区域及细胞激活区域，细胞内激活区域能延长细胞在体内的存活时间。另外本专利技术采用CRISPR/Cas9基因编辑的方法进行制备CAR-T细胞，提供一种高效制备CD105 CAR-T细胞的方法，该方法制备的CAR-T能稳定表达嵌合抗原受体，具有良好的应用前景。
附图说明
[0013]图1：T7E1检测表明gRNA对AAVS1位点有靶向敲除。其中，1-3泳道为PCR产物被切成3或3个条带以上；4-10泳道为对照，无变化。
[0014]图2：pLVX-CAR载体示意图。
[0015]图3：Puc-Mdonor载体酶切电泳图。其中，M表示15000bp marker；1表示未酶切；2表示KpnⅠ单酶切；3表示HindⅢ单酶切；4表示双酶切。
[0016]图4：CAR片段与Puc-Mdonor酶切载体连接后PCR鉴定图。其中，M表示15000bp marker；1表示Puc-Mdonor-mock；2表示Puc-Mdonor-CD19 CAR；3表示Puc-Mdonor-CD105 CAR。
[0017]图5：T细胞电转后表达GFP荧光。
[0018]图6：T细胞电转后CAR的表达。
[0019]图7：CD105 CAR-T特异性杀伤CD105阳性肿瘤细胞。
具体实施方式
[0020]如上所述，本专利技术在第一方面提供了一种含有CAR核酸片段的表达质粒，所述CAR核酸片段为嵌合抗原受体CD105 VHH-CD8-CD137-CD3ζ片段，由CD105 VHH、CD8铰链区和跨
膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。
[0021]在一些优选的实施方式中，所述CAR核酸片段如SEQ ID NO.1所示；优选的是，所述表达质粒为插入有所述CAR核酸片段的Puc-donor质粒。
[0022]本专利技术在第二方面提供了一种工程化CD105靶向性CAR-T细胞，所述CAR-T细胞转染有本专利技术第一方面所述的表达质粒。
[0023]在一些优选的实施方式中，所述CAR-T细胞还转染有包含人AAVS1基因的gRNA识别序列的第二质粒。更优选的是，所述gRNA识别序列如SEQ ID NO.2所示。进一步优选的是，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有CAR核酸片段的表达质粒，其特征在于，所述CAR核酸片段为嵌合抗原受体CD105 Nb-CD8-CD137-CD3ζ片段，由CD105 Nb、CD8铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。2.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述CAR核酸片段如SEQ ID NO.1所示；优选的是，所述表达质粒为插入有所述CAR核酸片段的Puc-donor质粒。3.一种工程化CD105靶向性CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞转染有权利要求1或2所述的表达质粒。4.根据权利要求3所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞还转染有包含人AAVS1基因的gRNA识别序列的第二质粒；优选的是，所述gRNA识别序列如SEQ ID NO.2所示；更优选的是，所述第二质粒为插入有所述gRNA识别序列的px330质粒。5.一种用于制备权利要求3或4所述的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备权利要求1或2所述的表达质粒；(2)将所述表达载体转染到T细胞中，从而获得CAR-T细胞的方法。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CAR核酸片段通过如下方法制备：(I)合成嵌合抗原受体CD105 VHH-CD8-CD137-CD3ζ核酸片段；(II)将所述核酸片段克隆至表达载体p LVX中，得到插入有所述核酸片段的pLVX-CAR质粒；(III)利用pLVX-CAR质粒通过PCR扩增所述核酸片段；(IV)将扩增得到的所述核酸片段插入到Puc-donor载体质粒中，得到插入有所述核酸片段的Puc-donor-CAR质粒；优选的是，在将扩增得到的所述核酸片段插入到Puc-donor载体质粒中时采用限制性内切酶KpnⅠ/HindⅢ对Puc-donor载体质粒进行双酶切。7.根据权利要求5或6...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢小玲，莫凤珍，杨晓梅，谢深霞，刘爱群，尹时华，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：