一种新的I型CRISPR/Cas系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种新的CRISPR/Cas基因组编辑系统及其应用。本发明专利技术提供构建的利用病原菌内源的CRISPR/Cas系统进行基因组编辑的两个质粒的表达载体，可以实现无标记基因残留的高效快速的基因组编辑。本发明专利技术还提供用所述基因组编辑系统编辑细菌基因组的方法。因组编辑系统编辑细菌基因组的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种新的I型CRISPR/Cas系统及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体而言，本专利技术涉及一种新的基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑系统及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系统是细菌和古细菌抵御外源DNA或RNA入侵的一种适应性免疫系统。在该系统基础上发展的基因组编辑工具CRISPR/Cas系统目前已广泛应用于植物、动物和微生物的基因组编辑。Cas核酸酶在向导RNA的靶向作用下对DNA双链进行切割，之后通过DNA修复途径进行修复。大多数细菌不具有DNA双链断裂末端修复的非同源末端连接(NHEJ)途径，可向细菌中转入同源片段通过同源重组(HR)进行DNA修复，实现基因组编辑。
[0003]在自然界中，将近一半的细菌自身就拥有CRISPR/Cas系统，利用细菌自身的CRISPR/Cas系统来编辑基因组可以消除表达外源Cas蛋白对细菌的毒性作用，并且，由于不需要向细菌中转化表达Cas核酸酶的质粒，可极大的简化基因编辑系统。目前，已在细菌Clostridium、Lactobacillus和Pseudomonas的一些菌株中，通过转入带有同源修复模板并表达靶定基因组的CRISPR阵列的质粒，成功利用自身的I型CRISPR/Cas系统实现了基因编辑。目前在植物病原菌中通过内源的CRISPR/Cas系统进行基因组编辑的方法还未有报道。

技术实现思路

[0004]本申请的专利技术人在植物病原菌水稻黄单胞菌中鉴定到一个新的I型CRISPR/Cas系统，并实现了利用内源CRISPR/Cas系统进行高效的基因组编辑。本专利技术可实现无标记基因残留的高效快速的基因组编辑方式。本专利技术提供了构建的基于内源CRISPR/Cas系统进行基因组编辑的表达载体。本专利技术还提供用所述基因组编辑系统编辑细胞基因组的方法。
[0005]具体而言，专利技术人通过如下项目所公开的技术方案解决了本领域中存在的上述问题：
[0006]1.一种基于植物病原菌内源的CRISPR/Cas系统的基因组编辑系统，其包含构建于一个或多个载体中的可操作地连接的λ-Red同源重组系统的编码核酸序列、用于靶定到基因组特定位置的crRNA的编码核酸序列和用于目标突变体构建的同源重组片段的核酸序列。
[0007]2.项目2所述的基因组编辑系统，其中所述载体为质粒。
[0008]3.项目1或2所述的基因组编辑系统，其中所述λ-Red同源重组系统的编码核酸序列构建于一个载体上，并且用于靶定到基因组特定位置的crRNA的编码核酸序列和用于目标突变体构建的同源重组片段的核酸序列构建于另一个载体上。
[0009]4.项目1-3任一项所述的方法，其中所述crRNA的加工成熟的核苷酸序列如SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:32任一项所示。
[0010]5.对细胞进行基因编辑的方法，其包括将项目1-6任一项所述的基因组编辑系统
引入所述细胞，其中所述细胞为细菌，优选黄单胞菌属(Xanthomonas)，更优选水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)的细胞，其中所述的基因组编辑系统和所述细胞内源的CRISPR/Cas组合实现对细胞基因组的编辑。
[0011]6.项目1-6任一项所述的基因组编辑系统在制备基因编辑细胞中的用途，其中所述基因编辑为基因敲除及替换等，优选多个基因的编辑。
[0012]7.一种分离的CRISPR/Cas系统，其包含或组成为如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
[0013]在另一个方面，本专利技术对内源CRISPR/Cas系统进行了详细分析，确定了crRNA的加工过程及方式、识别的PAM序列。
[0014]在另一个方面，本专利技术对细菌中的质粒进行高效的编辑，可进行质粒的消除，也可对质粒进行同源重组编辑。
[0015]在另一个方面，本专利技术涉及对crRNA与DNA间的错配对编辑效率的影响进行了分析。
附图说明
[0016]图1：PXO99
A
内源的I-C型CRISPR系统特征示意图。其中图1A显示PXO99内源的I-C型CRISPR/Cas系统组成。图1B为前体crRNA(precursor CRISPR RNA，pre-crRNA)加工成成熟crRNA示意图。黑色箭头代表切割位点。一个成熟的crRNA包含5
’
端11nt的柄，33-37nt的间隔序列以及3
’
端20nt的颈环结构。图1C为PXO99内源的CRISPR/Cas系统所识别的PAM预测结果。
[0017]图2：内源CRISPR/Cas系统可实现对PXO99
A
中质粒的编辑。其中图2A为测试内源CRISPR/Cas系统所用质粒图谱，其中pSEVA-egfpT表达可靶定到EGFP上的crRNA，pSEVA-egfpTD表达可靶定到EGFP上的crRNA并带有可与EGFP基因发生同源重组的同源片段；图2B为转化pSEVA-egfpT后的结果示意图，由于内源CRISPR/Cas系统对质粒DNA的切割，使得转化后的细菌丧失壮观霉素抗性；图2C为转化pSEVA-egfpTD后的结果示意图，由于利用同源片段对切割的质粒进行修复，转化后的细菌带有壮观霉素抗性；图2D显示带有不同组分的pSEVA系列载体转入含有pHM1-EGFP的PXO99
A
的菌落数统计结果及相关图片，转化用的质粒DNA量一致，转化后的细菌涂在含相同浓度抗生素的平板上，标尺＝1cm，CFU为菌落形成单位，HA表示同源臂。
[0018]图3：内源CRISPR/Cas系统可实现对XanB2基因的切割和编辑。其中图3A显示设计的靶向XanB2的间隔序列，PAM用下划线标注。图3B显示PXO99内源I-C型CRISPR/Cas系统与不同组分组合的突变效率，转化用的质粒DNA量一致，转化后的细菌涂在含相同浓度抗生素的平板上，HA为同源臂。
[0019]图4：错配对PXO99内源的CRISPR/Cas系统的编辑效率的影响。其中图4A显示设计的crRNA的突变类型，突变位点用下划线标注。图4B为不同突变类型的crRNA的突变效率，对照为未突变的crRNA，转化用的质粒DNA量一致，转化后的细菌涂在含相同浓度抗生素的平板上。
具体实施方式
[0020]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。
[0021]除非另外说明，否则本文所用的百分比浓度为质量体积百分比浓度。
[0022]除非另外说明，否则本文中所用的术语具有本领域所通常理解的含义。
[0023]特别地，本文所用的术语“可操作地连接”是指例如载体(例如质粒)中所连接的序列以实现其功能的方式连接。
[0024]方法
[0025]pH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于植物病原菌内源的CRISPR/Cas系统的基因组编辑系统，其包含构建于一个或多个载体中的可操作地连接的λ-Red同源重组系统的编码核酸序列、用于靶定到基因组特定位置的crRNA的编码核酸序列和用于目标突变体构建的同源重组片段的核酸序列。2.权利要求2所述的基因组编辑系统，其中所述载体为质粒。3.权利要求1或2所述的基因组编辑系统，其中所述λ-Red同源重组系统的编码核酸序列构建于一个载体上，并且用于靶定到基因组特定位置的crRNA的编码核酸序列和用于目标突变体构建的同源重组片段的核酸序列构建于另一个载体上。4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述crRNA的加工成熟的核苷酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱金龙，姜丹丹，张丹丹，尹康权，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：