用于合成橄榄醇酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于合成橄榄醇酸的构建体，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的第一基因和第二基因，其中第一基因是TKS基因和OAC基因联合基因TKS/OAC，其序列如SEQ ID NO.2所示，第二基因是酰基活化酶基因，其序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术还涉及包含有所述构建体的载体和包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法。TKS基因与OAC基因的联合基因TKS/OAC会将蓝藻光合作用产生的丙二酰辅酶A和己酰辅酶A催化合成橄榄醇酸。本发明专利技术以蓝藻为底盘生物进行改造合成橄榄醇酸，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，因此相较于其它生产方法，生产成本大幅度降低。本大幅度降低。本大幅度降低。

【技术实现步骤摘要】
用于合成橄榄醇酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法


[0001]本专利技术涉及合成生物
，具体而言，涉及一种用于合成橄榄醇酸的构建体，包含有所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法。

技术介绍

[0002]蓝藻(Cyanobacteria)可以进行厌氧型光合作用的大型单细胞原核生物，可以进行光合作用并以水为电子受体进行放氧。它的发展使整个地球大气从无氧状态发展到有氧状态，从而孕育了一切好氧生物的进化和发展。蓝藻作为碳固定场所，可以固定大气中的CO2(一定程度上减轻CO2过多引起的环境问题)。集胞藻PCC6803(Synechocystis sp.PCC 6803)是一种单细胞球形蓝藻，能利用光能进行自养生长，又能利用葡萄糖进行异养生长。
[0003]蓝细菌(蓝藻，Cyanobacterium，Blue
‑
green algae)是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核微生物，它作为新一代能源微生物系统具有如下优势：(1)蓝细菌能够吸收太阳能、固定二氧化碳作为碳源进行自养生长，培养成本低；(2)蓝细菌是一类古老的微生物，已在地球上存在了几十亿年，它们对环境适应能力强，生长迅速；(3)蓝细菌遗传操作方便，遗传背景清晰，许多种类的基因组测序工作也已经陆续完成，这使得利用基因工程手段改造蓝细菌非常方便。其中，集胞藻Synechocystis sp.PCC6803是单细胞蓝细菌的代表物种，其全基因组测序于1996年完成，是最早完成全基因组测序的光合微生物，也是目前研究最多的蓝细菌之一。
[0004]橄榄醇酸(OLA)是一种来源于III型聚酮合成酶(PKS IIIs)催化作用的植物次生代谢物，与其戊烯基化衍生物一起具有多种药理活性。单芳化合物橄榄醇酸(OLA)是PKS III产品类的一员，具有抗菌、细胞毒性和光保护等药理活性。此外，橄榄醇酸是合成一类重要的药理化合物的中心中间体，因为它在大麻类化合物的生物合成过程中充当烷基间苯二酚部分，这类产品因其众多的药理性质而变得越来越重要。
[0005]目前，橄榄醇酸及其衍生物的生产主要是通过从植物中直接提取，但由于植物生长缓慢，这些化合物的积累至少需要几个月的时间，直接提取的周期较长。虽然植物生物技术提供了改善本地物种天然产物合成的机会，但精确控制转基因在植物中的表达水平并适应工业化生产是困难的。虽然橄榄醇酸的化学合成是最近报道的另一种选择，但大多数天然产物的结构复杂性决定了全化学合成固有的低效率，这导致了低产率和高能源浪费。与这些方法相比，建造微生物细胞工厂来生产这些增值的植物天然产物是一个很有前途的策略。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的不足，本申请首次成功地构建生物合成橄榄醇酸的蓝细菌所需的构建体。载体和菌株，并验证该构建方法具有良好的可行性，提供了一种在蓝细菌中生产
橄榄醇酸的方法，该方法具有产量高，无污染，生产周期短，成本低且环保的优点。
[0007]为解决上述问题，本专利技术提供一种用于合成橄榄醇酸的构建体，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的第一基因和第二基因，其中第一基因是丁烯酮合成酶基因和橄榄醇酸环化酶基因联合基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，第二基因是酰基活化酶基因，其序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]可选地，其包含有处于所述在蓝细菌中具有活性的启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。
[0009]可选地，所述标记基因为壮观霉素抗性基因片段，所述壮观霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]可选地，其在两端具有集胞藻PCC6803的slr0168基因的N
‑
末端序列和C
‑
末端序列，以用于同源重组。
[0011]可选地，在所述蓝细菌中具有活性的启动子为P
cpc560
。
[0012]可选地，所述蓝细菌为集胞藻PCC6803。
[0013]一种载体，其包含上述任一所述的用于合成橄榄醇酸的构建体。
[0014]包含上述任一所述的用于合成橄榄醇酸的构建体的蓝细菌。
[0015]用所述的载体转化的蓝细菌。
[0016]一种在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法，所述方法包括：在合适于合成橄榄醇酸的条件下培养上述蓝细菌；以及从所获得的培养物中提取所述的橄榄醇酸。
[0017]本专利技术合成橄榄醇酸与现有技术的不同之处在于：
[0018]1)本专利技术使用基因工程技术将橄榄醇酸合成的外源关键功能基因引入到集胞藻PCC6803基因组中，首次成功地在集胞藻PCC6803中构建了一条高效合成生物橄榄醇酸的代谢途径，在蓝细菌生长过程合成出橄榄醇酸。
[0019]2)本专利技术利用超强启动性的光强启动子P
cpc560
驱动来源于大麻毛状体的丁烯酮合成酶基因(TKS)与橄榄醇酸环化酶基因(OAC)在蓝细菌中一个和多个基因位点高效表达，提高橄榄醇酸的产量。
[0020]3)首次以蓝细菌为底盘生物进行改造合成橄榄醇酸，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，不需要大量用电，因此相较于其它生产方法，生产成本大幅度降低。
[0021]4)合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产，本专利技术工艺从经济、环境和职业健康角度均为优良的工业化生产指路线。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例中质粒pMDslr0168的基本结构图；
[0023]图2为本专利技术实施例中重组质粒pMDslr0168
‑
Ω的基本结构图；
[0024]图3为本专利技术实施例中重组质粒pMD0168的基本结构图；
[0025]图4为本专利技术实施例中重组质粒pMD0168
‑
TKS/OAC的基本结构图；
[0026]图5为本专利技术实施例中重组质粒pMD
‑
TKS/OAC/AAE的基本结构图；
[0027]图6为本专利技术实施例中蓝细菌生物合成橄榄醇酸的代谢流程；
[0028]图7为本专利技术实施例中蓝细菌生成的橄榄醇酸的HPLC检测图；
[0029]图8为14天培养周期内本专利技术实施例中蓝细菌与野生型蓝细菌的生长情况对比图。
具体实施方式
[0030]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施例做详细的说明。
[0031]在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。本文中所涉及的菌株培养，分子生物学，分子遗传学等操作步骤均为相应领域内广泛的常规步骤。同时为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。
[0032]如本专利技术中所使用的“蓝细菌(Cyanobacteria)”是一类光和自养的原核微生物，其能够利用太阳能固定二氧化碳。蓝细菌也称为蓝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于合成橄榄醇酸的构建体，其特征在于，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的第一基因和第二基因，其中第一基因是丁烯酮合成酶基因和橄榄醇酸环化酶基因联合基因，其序列如SEQ ID NO.2 所示，第二基因是酰基活化酶基因，其序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的用于合成橄榄醇酸的构建体，其特征在于：其包含有处于所述在蓝细菌中具有活性的启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。3.根据权利要求2所述的用于合成橄榄醇酸的构建体，其特征在于：所述标记基因为壮观霉素抗性基因片段，所述壮观霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求1所述的用于合成橄榄醇酸的构建体，其特征在于：其在两端具有集胞藻PCC6803的slr0168基因的N
‑
末端序列和C
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴军华，邱海燕，高恶斌，
申请(专利权)人：宁波市妇女儿童医院，
类型：发明
国别省市：