一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法，涉及基因工程和代谢工程领域。所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，命名为伯克霍尔德氏菌JP2

【技术实现步骤摘要】
一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程和代谢工程领域，具体涉及一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法。

技术介绍

[0002]伯克氏菌目属于细菌中变形菌门的β
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变形菌纲，被发现能够存在于水和土壤等多种生态环境中，包括具有致病性的一属和环境友好型的一属。据统计，伯克氏菌能够分泌包括各种具有蛋白水解活性和溶血活性的胞外酶在内的多种次级代谢产物。伯克氏菌中聚酮合酶途径和非核糖体多肽途径的总量只低于放线菌，伯克氏菌目前成为继放线菌之后的天然产物来源的第二大类细菌，然而其中大部分生物合成基因簇为未开发或者沉默的，想要对这些未知基因簇加以开发和利用，则必须借助有效的基因操作工具和表达宿主实现未知基因簇的原位激活和异源表达。
[0003]申请人前期的专利申请，公开号为CN109234211A的专利技术申请公开了一株伯克霍尔德氏菌JP2
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270(保藏编号为CCTCC NO：M 2018703)，是一株分离自水稻根系的革兰氏阴性生防细菌，其对水稻纹枯病、稻瘟病和恶苗病具有抑菌作用，具有一定的防治效果。JP2
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270属于洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderiacepacia Complex，Bcc)，该菌群是一组表型相近但基因型不同的复合物。
[0004]2020年，Hertweck和Challis课题组在确认戊二酰亚胺单元的核心生物合成基因后，先后通过基因组挖掘的手段，从伯克霍尔德氏菌中鉴定出新型戊二酰亚胺类天然产物剑兰制霉菌素(Genomics
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driven discovery of a novel glutarimide antibiotic from Burkholderia gladioli reveals an unusual polyketide synthase chain release mechanism,Angewandte Chemie International Edition,2020)。剑兰制霉菌素对几种人类癌细胞系具有良好的活性并抑制肿瘤细胞迁移，它含有一种不寻常的2
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酰基
‑4‑
羟基
‑3‑
甲基丁烯内酯。聚酮合酶的C端的AfsA
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样结构域被证明可以催化3
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酮硫酯与磷酸二羟基丙酮的缩合，因此表明它在聚酮链释放和丁烯内酯形成中起关键作用。
[0005]随着公共基因组信息的倍数增加，利用基因组挖掘策略，有望发现更多具有新颖结构和良好活性的戊二酰亚胺类天然产物。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种用于生产双氢剑兰制霉菌素(dihydrogladiostatin)的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)及其制备方法。
[0007]本专利技术提供了一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，命名为伯克霍尔德氏菌JP2
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270Δ38940，由伯克霍尔德氏菌JP2
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270敲除了DM992_38940基因得到，双氢剑兰制霉菌素的化学结构式如如图11所示。优选的，DM992_38940基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]具体的，将基因序列如SEQ ID NO.3所示的插入基因片段38940up和基因序列如SEQ ID NO.4所示的插入基因片段38940dw同时连接至制备的线性化pK18mobSacB载体上，制备用于DM992_38940基因敲除质粒pK18
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38940，将质粒pK18
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38940转入伯克霍尔德氏菌JP2
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270感受态细胞，筛选获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，其中质粒pK18
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38940的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
[0009]本专利技术还提供了用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌在制备双氢剑兰制霉菌素中的应用。
[0010]本专利技术还提供了一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌的制备方法，方法如下：将伯克霍尔德氏菌JP2
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270中DM992_38940基因敲除，获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌。具体的，基因敲除的具体步骤如下：基因敲除时，将基因序列如SEQ ID NO.3所示的插入基因片段38940up和基因序列如SEQ ID NO.4所示的插入基因片段38940dw同时连接到制备的线性化pK18mobSacB载体上，制备用于基因敲除的质粒pK18
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38940，将质粒pK18
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38940转入伯克霍尔德氏菌JP2
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270感受态细胞，筛选得到用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌。优选的，采用电转化法，将质粒pK18
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38940转入伯克霍尔德氏菌JP2
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270感受态细胞。
[0011]本专利技术提供了一种用于制备双氢剑兰制霉菌素的方法，方法如下：发酵培养用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌后，将获得的发酵液采用乙酸乙酯抽提，抽提液进行旋转蒸发并收集沉淀物，沉淀物用甲醇溶液溶解后得到粗提物；粗提物依次经Sephadex LH
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20色谱柱分离和ODS柱纯化得到双氢剑兰制霉菌素。具体的，所述粗提物经Sephadex LH
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20色谱柱分离，用无水甲醇洗脱，得到10个馏分；将第5馏分进一步用ODS柱进行纯化，用80％的甲醇洗脱，得到12个馏分，在第5个馏分中得到双氢剑兰制霉菌素。
[0012]本专利技术还提供了一种抗肿瘤化合物，命名为双氢剑兰制霉菌素，其化学结构式如图11所示。
[0013]本专利技术还提供了所述的抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，肿瘤类型为胶质瘤。
[0014]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，且其制备方法简单便捷。伯克霍尔德氏菌JP2
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270产剑兰制霉菌素而基本不产双氢剑兰制霉菌素，或产生的双氢剑兰制霉菌素量少不足以检测到。本申请研究发现将该菌株的DM992_38940基因敲除后，得到的基因敲除菌株伯克霍尔德氏菌JP2
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270Δ38940能够产双氢剑兰制霉菌素，产生的双氢剑兰制霉菌素量大，且该双氢剑兰制霉菌素具有更好的抗肿瘤作用，特别是对胶质瘤具有更好的活性，在制备治疗肿瘤疾病药物方面具有潜在价值。
附图说明
[0015]图1为JP2
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270(A)和JP2
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270Δ38940(B)代谢粗提物HPLC分析图。
[0016]图2为剑兰制霉菌素(A)和双氢剑兰制霉菌素(B)高分辨率质谱图。
[0017]图3为剑兰制霉菌素(A)和双氢剑兰制霉菌素(B)1H谱图。
[0018]图4为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)，命名为伯克霍尔德氏菌JP2
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270Δ38940，由伯克霍尔德氏菌JP2
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270敲除了DM992_38940基因得到，双氢剑兰制霉菌素的化学结构式如式Ⅰ所示：2.如权利要求1所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，其特征在于，DM992_38940基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求2所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，其特征在于，将基因序列如SEQ ID NO.3所示的插入基因片段38940up和基因序列如SEQ ID NO.4所示的插入基因片段38940dw同时连接至制备的线性化pK18mobSacB载体上，制备用于DM992_38940基因敲除质粒pK18
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38940，将质粒pK18
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38940转入伯克霍尔德氏菌JP2
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270感受态细胞，筛选获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，其中质粒pK18
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38940的基因序列如SEQ ID NO.5所示。4.如权利要求1
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3任一项所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌在制备双氢剑兰制霉菌素中的应用。5.权利要求1所述用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌的制备方法，其特征在于，将伯克霍尔德氏菌JP2
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270中DM992_38...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴丽娟，鄂志国，张治针，王磊，王惠梅，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：