用于诊断和治疗癌症的DNA构建体制造技术

本发明专利技术涉及一种DNA构建体，以及其中已导入了包含该DNA构建体的重组载体的菌株。本发明专利技术的DNA构建体允许可操作连接于第一和第二启动子下游的基因的表达水平在宿主菌株或细胞中达到平衡，使得癌症诊断和治疗可以同时进行。此外，本发明专利技术的DNA构建体在没有多西环素的情况下，完全不允许抗癌蛋白和报告蛋白表达，因此它能调控多西环素的使用，从而允许抗癌蛋白以用于癌症治疗的适当剂量进行表达，同时它能根据报告蛋白的表达水平实现对癌症规模的实时监测。实时监测。实时监测。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于诊断和治疗癌症的DNA构建体


[0001]本专利技术涉及一种用于诊断和治疗癌症的DNA构建体，以及一种已导入包含所述DNA构建体的重组载体的菌株。

技术介绍

[0002]迄今为止，大多数癌症已经通过与手术、放疗、化疗或其组合相对应的各种方法进行治疗。用于切除大部分癌组织的外科手术可能在切除位于特定区域，例如乳房、结肠或皮肤的癌组织方面非常有效，但难以用于治疗某些区域如脊柱的癌组织。此外，对于治疗乳腺癌、肺癌和睾丸癌时常用的全身化疗，可能会诱发破坏正常细胞复制或代谢过程的副作用，并且患者可能会对化疗中使用的治疗剂产生耐药性。
[0003]同时，当个体罹患癌症时，血管形成和细胞生长在体内以非常快的速度进行，因此可能由于血管形成不完全而在癌组织中造成缺氧环境，并且所述癌组织可能非常适合厌氧菌如沙门氏菌菌株或大肠杆菌的生长。因此，目前的癌症疗法使用能够靶向癌症的细菌，例如沙门氏菌(Salmonella)菌株和梭菌属(Clostridium)菌株，基于特定细菌能靶向实体瘤并在肿瘤内增殖的功能。然而，当将溶瘤蛋白或报告蛋白导入细菌中并将经转化的细菌施用于个体时，可以特异性识别癌组织或通过最小化对正常细胞有毒性的副作用来治疗癌症。
[0004]人类疾病是由自然界中存在的各种细菌病原体分泌的毒素引起的。在可以引起疾病的各种细菌病原体中，与我们的饮食密切相关的菌株如沙门氏菌(Salmonella enterica)等被称为肠杆菌科，它们栖息在包括人类在内的灵长类动物的肠道中，并分泌被称为外毒素的溶细胞素。以这种方式分泌的溶细胞素是一种具有约34kDa分子量的细胞毒性蛋白，已知其会在包括人类在内的灵长类动物的肠道中引起溶血(红细胞的破坏)并在正常细胞的膜上形成孔洞，诱导细胞裂解，诱发严重的血管炎症和局部组织坏死而导致死亡。然而，最近的研究结果表明，从沙门氏菌中分离纯化的溶细胞素特异性作用于肠道中存在的癌细胞，从而诱导癌细胞死亡。因此，溶细胞素作为下一代抗癌治疗剂受到了关注。故使用分泌细胞毒性物质溶细胞素的基因转化的细菌，作为靶向癌组织的抗癌治疗剂，可能具有非常高的潜力。
[0005]如上所述,尽管可以使用细菌来诊断或治疗癌症，但几乎没有关于允许适于诊断和治疗的蛋白质在癌组织中进行特异性表达的表达载体的研究。将细菌注入生物体内后，前3天在如肝和脾等网状内皮系统中出现清除，一段时间后，癌组织中的细菌迅速增加。因此，就安全性而言，需要在一定时间之后才允许治疗性蛋白质的表达。据此，推荐使用诱导型启动子来表达治疗性蛋白质，但诱导型启动子的临床应用受到很大限制，例如目前在实验阶段使用的P
BAD
启动子，因为L
‑
阿拉伯糖不允许供人使用，但其必须用作诱导剂。利用多西环素(一种准许供人使用的抗生素)的P
tet
启动子，其优点在于它在临床上相对容易使用并且允许使用TetA启动子和TetR启动子的两个基因的双向转录。然而，TetA启动子和TetR启动子之间的蛋白质表达水平差异为100:1或更大，因此需要平衡这些启动子的表达水平
以增加P
tet
启动子的效用。据此，有必要开发一种新技术，使转化的细菌具有可临床应用形式的表达系统并平衡蛋白质表达水平。
[0006]专利技术详述
[0007]技术问题
[0008]本专利技术的一个目的是提供一种DNA构建体。
[0009]本专利技术的另一个目的是提供一种包含该DNA构建体的重组载体。
[0010]本专利技术的又一目的是提供：一种已导入所述重组载体的菌株，以及一种包含该菌株的用于诊断癌症的组合物。
[0011]本专利技术的又一目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，该药物组合物含有所述菌株作为活性成分。
[0012]本专利技术的又一目的是提供一种为癌症诊断提供信息的方法，该方法包括用所述菌株进行治疗的步骤。
[0013]然而，本专利技术所要解决的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员通过以下描述能清楚地理解本文未提及的其他问题。
[0014]技术方案
[0015]本专利技术的一个实施方式提供了一种DNA构建体。
[0016]本专利技术的DNA构建体包含：编码调节蛋白的基因；和由调节蛋白诱导的第一启动子和第二启动子。
[0017]任一种选自下组的基因：编码抗癌蛋白的基因、编码细胞因子的基因、编码趋化因子的基因、编码免疫调节剂的基因、癌抗原特异性寡核苷酸和编码报告蛋白的基因，均能可操作连接于本专利技术的第一启动子和第二启动子的下游。
[0018]由于本专利技术的第一启动子和第二启动子同时被由单独的启动子表达的单个调节蛋白诱导，在宿主菌株或细胞中，与可操作连接于第二启动子下游的调节蛋白基因的编码基因情况不同，可操作连接于第一启动子和第二启动子下游的基因其编码蛋白质的表达水平可以彼此平衡。因此，当使用本专利技术的DNA构建体时，可以同时进行诊断和治疗。
[0019]本专利技术中使用的术语“DNA构建体”是指一种当通过转化导入宿主菌株或细胞时能够表达所需蛋白质或其类似物的构建体，并且该构建体不仅包括编码所需蛋白质的基因，还包括对应于启动子的核苷酸序列，它们是可操作连接的必要调控元件，以便基因能够表达。
[0020]本专利技术中使用的术语“启动子”是指存在于宿主菌株或细胞中可操作连接的基因上游的核苷酸序列，并且是DNA构建体上RNA聚合酶可结合以启动转录的特定区域的核苷酸序列。
[0021]本专利技术调节蛋白的表达可以通过顺式作用元件(cis
‑
regulatory elements；CRE)或反式作用因子(trans
‑
regulatory elements；TRE)来调节。
[0022]在本专利技术中，术语“调节”、“表达的调节”可以指特定基因的转录和翻译被激活或抑制。
[0023]本专利技术的顺式作用因子是非编码DNA中调控邻近基因转录的区域，是基因调控网络的重要组成部分，控制基因表达。顺式作用因子可为选自下组的至少一种：核糖体结合位点(RBS)、5'
‑
非翻译区(5'
‑
UTR)、转录因子结合位点和终止子，但不限于此。
[0024]在本专利技术中，核糖体结合位点(RBS)也称为Shine
‑
Dalgarno序列(SD序列)。在DNA中包含的遗传信息转录成信使RNA(mRNA)后，核糖体必须与该mRNA结合才能进行翻译。此时，核糖体结合位点是指存在于mRNA上的一段短序列，使核糖体可以有效地与mRNA结合。
[0025]在本专利技术中，5'
‑
非翻译区(5'
‑
UTR)是指位于被翻译成mRNA氨基酸的5'编码区两侧的非翻译区。它被认为是进化过程中的废弃物，但众所周知，它在调节基因表达方面发挥着重要作用。
[0026]在本专利技术中，转录因子结合位点是用于开启或关闭附近特定基因的DNA区域。转录因子结合位点可以是选自下组的至少一种：编本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种DNA构建体，包括编码调节蛋白的基因；和由调节蛋白诱导的第一启动子和第二启动子。2.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述第一启动子为tetA启动子，所述第二启动子为tetR启动子。3.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述调节蛋白为TetR蛋白。4.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述调节蛋白的表达受顺式作用元件或反式作用元件的调节。5.如权利要求4所述的DNA构建体，其中所述顺式作用因子为选自下组的至少一种：核糖体结合位点即RBS、5'
‑
非翻译区即5'
‑
UTR、转录因子结合位点和终止子。6.如权利要求5所述的DNA构建体，其中所述转录因子结合位点为选自下组的至少一种：编码调节蛋白的基因的启动子、增强子和沉默子。7.如权利要求6所述的DNA构建体，其中所述编码调节蛋白的基因的启动子为弱启动子。8.如权利要求7所述的DNA构建体，其中所述弱启动子诱导转录自可操作连接于所述启动子下游的基因的转录物以1
×
10
‑2或更低的水平表达。9.如权利要求4所述的DNA构建体，其中所述反式作用因子为选自下组的至少一种：转录因子、适体、sRNA和反义RNA即asRNA。10.如权利要求1所述的DNA构建体，其中任一种基因均能可操作连接于所述第一启动子和第二启动子的下游，所述基因选自下组：编码抗癌蛋白的基因、编码细胞因子的基因、编码趋化因子的基因、编码免疫调节剂的基因、癌抗原特异性寡核苷酸和编码报告蛋白的基因。11.如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述抗癌蛋白为选自下组的至少一种：毒素蛋白、癌抗原特异性抗体或其抗体片段、肿瘤抑制蛋白、血管生成抑制剂、癌抗原、前药转化酶和促凋亡蛋白。12.如权利要求11所述的DNA构建体，其中所述毒素蛋白为选自下组的至少一种：蓖麻毒素、肥皂草素、白树毒素、苦瓜毒素、德布加宁即debouganin、白喉毒素、假单胞菌毒素、溶血素(HlyA)、FAS配体(FASL)、肿瘤坏死因子
‑
α(TNF
‑
α)、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)和细胞溶素A(ClyA)。13.如权利要求11所述的DNA构建体，其中所述肿瘤抑制蛋白为选自下组的至少一种：成视网膜细胞瘤(RB蛋白)、p53蛋白、腺瘤性息肉病(APC蛋白)、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN蛋白)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A蛋白)。14.如权利要求11所述的DNA构建体，其中所述血管生成抑制剂为选自下组的至少一种：血管抑制素、内皮抑制素、血小板反应蛋白和蛋白酶抑制蛋白。15.如权利要求11所述的DNA构建体，其中所述癌抗原为选自下组的至少一种：甲胎蛋白(AFP)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、生存素、乐古曼(Legumain)、前列腺癌特异性抗原(PCSA)。16.如权利要求11所述的DNA构建体，其中所述前药转化酶为选自下组的至少一种：胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、嘌呤核苷磷酸化酶、羧肽酶G2、铬酸还原酶YieF、单纯
疱疹病毒I型胸苷激酶/更昔洛韦(HSV1
‑
TK/GCV)和β
‑
葡萄糖醛酸酶。17.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：闵政准，崔贤一，洪荣振，刘成焕，宋美怜，
申请(专利权)人：希安库尔生物科技公司，
类型：发明
国别省市：