农杆菌同源重组系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了农杆菌同源重组系统，该重组系统由一系列农杆菌同源重组系统表达质粒构成，分别命名为pBBR1

【技术实现步骤摘要】
农杆菌同源重组系统及其应用


[0001]本专利技术涉及一种革兰氏阴性菌中的同源重组系统及其构建与应用，尤其涉及一种农杆菌的同源重组系统及其构建与应用，属于微生物基因工程领域。

技术介绍

[0002]RecET及Redαβγ系统介导的同源重组过程统称Red/ET同源重组工程。Red/ET同源重组工程可以对大肠杆菌基因组任意位置的靶基因进行精确地插入、敲除或替换等修饰，与位点特异性重组酶(Cre/loxP、Flp/FRT)或CRISPR
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Cas等系统连用可实现大肠杆菌基因组的精简。Red/ET重组工程的成功运用推动了整个基因工程技术的发展，其中RecE和RecT同源重组蛋白来源于Rac原噬菌体，Redα、Redβ及Redγ同源重组蛋白来源于Lambda噬菌体。
[0003]Red/ET同源重组工程实现了低耗、高效、精确的基因组编辑，为基因遗传修饰提供了有效手段，其中RecE和Redα具有5'
–
3'的核酸外切酶活性，RecT和Redβ是单链DNA退火蛋白，Redγ可以抑制大肠杆菌中RecBCD的核酸外切酶活性，保护外源线性DNA分子免受降解，从而提高同源重组效率。
[0004]由于噬菌体重组酶具有一定的宿主特异性，Red/ET系统在亲缘关系较远的细菌中重组效率非常低或者没有重组功能，因此需要挖掘适用于不同菌株自身的同源重组系统。已有报道通过利用噬菌体重组功能操纵子构建的重组系统，如耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis、丁香假单胞菌Pseudomonas syringae pv.Syringae、、罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri、发光杆菌属Photorhabdus、嗜线虫致病杆菌属Xenorhabdus、伯克氏菌Burkholderiales strain、结核分支杆菌Mycobacterium tuberculosis、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis等等。
[0005]农杆菌(Agrobacterium)归属于根瘤菌科(Rhizobiaceae)，根据其是否具有侵染性以及农杆菌的寄主范围和感染症状将其分为能感染植物的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，无感染能力的放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)，以及可以导致植物长出毛状根的发根农杆菌(Rhizobium rhizogenes)。根癌及发根农杆菌能将自身质粒所携带的一段DNA(transferred DNA，T
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DNA)转移并整合至寄主植物基因组，T
‑
DNA区域内的基因可以被任何DNA序列代替，使得它对基因转移研究，植物基因功能研究以及农作物转基因育种等方面都具有极其重要的意义。提高农杆菌的转化效率和扩展其寄主范围还存在许多亟待解决的问题，因此在农杆菌中建立起一套高效、简捷的同源重组系统非常必要。经检索，有关农杆菌自身同源重组系统及其构建与应用的研究未见有文献报道。

技术实现思路

[0006]针对农杆菌中缺乏高效简便的遗传操作系统的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种农杆菌的同源重组系统及其构建与应用。
[0007]本专利技术技术方案是：挖掘农杆菌噬菌体同源重组蛋白，构建农杆菌同源重组系统表达质粒，对并同源重组系统表达质粒在根癌农杆菌中的重组条件进行优化，选出最优重
组工作条件，实现农杆菌同源重组系统在农杆菌中介导短同源臂的同源重组进行基因组DNA遗传修饰中的应用，或在农杆菌中进行基因敲除的应用。
[0008]本专利技术所述的农杆菌同源重组系统由一系列农杆菌同源重组系统表达质粒构成，包括pBBR1复制起点、卡那霉素抗性基因、四环素诱导型启动子以及农杆菌来源同源重组操纵子(如图1所示)；其特征在于：所述农杆菌同源重组系统表达质粒分别命名为pBBR1
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kan
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P
tet
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ETh1h2h3h4_agroB6、其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；pBBR1
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kan
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P
tet
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ETh1h2h3P3_rhi597、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；pBBR1
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kan
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P
tet
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ET_rhi145、其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；pBBR1
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kan
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P
tet
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ETh_rhi483、其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示(如图2所示)；pBBR1
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kan
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P
tet
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redγ
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ETh1h2h3h4_agroB6；pBBR1
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kan
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P
tet
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redγ
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ETh1h2h3P3_rhi597；pBBR1
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kan
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P
tet
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redγ
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ET_rhi145；pBBR1
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kan
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P
tet
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redγ
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ETh_rhi483；pBBR1
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kan
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P
tet
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pluγ
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ETh1h2h3h4_agroB6；pBBR1
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kan
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P
tet
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pluγ
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ETh1h2h3P3_rhi597；pBBR1
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kan
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P
tet
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pluγ
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ET_rhi145；pBBR1
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kan
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P
tet
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pluγ
‑
ETh_rhi483；农杆菌同源重组系统表达质粒涉及的同源重组酶操纵子ETh1h2h3h4
AGROB6
、ETh1h2h3P3
RHI597
、ET
RHI145
和ETh
RHI483
分别来源于农杆菌Agrobacterium tumefaciens str.B6、Rhizobium leguminosarum bv.trifoliiWSM597、Rhizobium sp.LC145和Rhizobium sp.Root483D2。
[0009]上述农杆菌同源重组系统表达质粒的构建方法，步骤如下：
[0010](1)pBBR1
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kan
‑
P
tet
‑
firefly为初始质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌同源重组系统，该重组系统由一系列农杆菌同源重组系统表达质粒构成，包括pBBR1复制起点、卡那霉素抗性基因、四环素诱导型启动子以及农杆菌来源同源重组操纵子；其特征在于：所述农杆菌同源重组系统表达质粒分别命名为pBBR1
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kan
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P
tet
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ETh1h2h3h4_agroB6、其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；pBBR1
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kan
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P
tet
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ETh1h2h3P3_rhi597、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；pBBR1
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kan
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P
tet
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ET_rhi145、其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；pBBR1
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kan
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P
tet
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ETh_rhi483、其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中涉及的同源重组酶操纵子ETh1h2h3h4
AGROB6
、ETh1h2h3P3
RHI597
、ET
RHI145
和ETh
RHI483
分别来源于农杆菌Agrobacterium tumefaciens str.B6、Rhizobium leguminosarum bv.trifoliiWSM597、Rhizobium sp.LC145和Rhizobium sp.Root483D2。2.权利要求1所述农杆菌同源重组系统在农杆菌中介导短同源臂的同源重组进行基因组DNA遗传修饰中的应用，其中所述短同源臂是指80bp
‑
200bp的同源臂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述农杆菌同源重组系统的系列表达质粒是pBBR1
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kan
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P
tet
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pluγ
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ET_rhi145、pBBR1
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kan
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P
tet
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ETh1h2h3h4_agroB6、pBBR1
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kan
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P
tet
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ET_rhi145或pBBR1
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kan
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P
tet
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ETh_rhi483；所述农杆菌是Agrobacterium tumefaci...

【专利技术属性】
技术研发人员：符军，李瑞娟，边志龙，李珊珊，杨润雨，涂强，张友明，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：