一种提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量的方法及应用技术

本发明专利技术公开了制备用于生产吡咯喹啉醌的工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：将甲基营养菌的基因组中TCS3替换为筛选标记基因，从而获得用于生产吡咯喹啉醌的工程菌。本发明专利技术中的敲除菌J1

【技术实现步骤摘要】
一种提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体的说，涉及一种提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量的方法及其应用。

技术介绍

[0002]吡咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinone，PQQ)是甲基营养菌合成的一种醌类化合物，是一种红棕色小分子化合物，为NAD(P)和FAD之外的第三类氧化还原酶辅酶。具有重要的生理功能如清除氧自由基、增强线粒体功能、调节免疫、促进认知、防治辐射损伤和肝损伤、促进创伤愈合等。PQQ的化学合成工艺复杂、污染严重、成本高昂，微生物发酵是目前PQQ工业化制备的工艺。革兰氏阴性菌是报道最多能够合成PQQ的生物类群，其中又以甲基营养菌合成水平最高。前期从土壤中筛选到多株能产PQQ的甲基营养菌，选取其中产量最高的一株(MP688)通过紫外、亚硝基胍等方法进行连续诱变，得到了PQQ高产菌J1
‑
1。目前继续通过物理、化学法诱变进一步提高PQQ产量已经很难，急需寻求另一种有效手段。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在通过代谢工程改造获得PQQ高产菌株，进一步利用PQQ高产菌株得到提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量的方法及其应用。
[0004]本专利技术提供一种制备用于生产吡咯喹啉醌的工程菌的方法，包括如下步骤：将甲基营养菌的基因组中TCS3替换为筛选标记基因，从而获得用于生产吡咯喹啉醌的工程菌；所述TCS3的序列如序列表中序列1所示。
[0005]进一步，所述筛选标记基因为Gm基因；所述Gm基因的序列为序列表中序列2。
[0006]进一步，所述甲基营养菌为甲基营养菌J1
‑
1。
[0007]进一步，所述甲基营养菌J1
‑
1中的TCS3是通过同源重组的方式替换为Gm基因的，上游同源臂的序列如序列表中序列3所示，下游同源臂的序列如序列表中序列4所示。
[0008]进一步，所述方法包括如下步骤：向甲基营养菌J1
‑
1中导入重组载体，所述重组载体中含有自5
’
端到3
’
端依次相连的所述上游同源臂、所述Gm基因和所述下游同源臂，所述上游同源臂和所述下游同源臂与所述甲基营养菌J1
‑
1的基因组上的同源片段发生同源重组，即得所述用于生产吡咯喹啉醌的工程菌。
[0009]进一步，所述重组载体为在pWM91载体的酶切位点BamH I和Apa I之间插入自5
’
端到3
’
端依次相连的所述上游同源臂、所述Gm基因和所述下游同源臂后得到的重组质粒。
[0010]上述方法制备得到用于生产吡咯喹啉醌的工程菌也应在本专利技术的保护范围之内。
[0011]上述方法或者上述的工程菌在生产吡咯喹啉醌中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。
[0012]本专利技术还提供一种生产吡咯喹啉醌的方法，将上述工程菌进行发酵培养，从发酵产物中制得吡咯喹啉醌。
[0013]所述发酵产物是指上述工程菌进行发酵培养后得到的发酵液。
[0014]本专利技术中的敲除菌J1
‑1△
mpq
‑
0782
‑
0783的生长速率快于野生菌J1
‑
1，到达平台期的时间较短，到达平台期后最大OD
600
值比野生菌J1
‑
1高7.7％。PQQ生产速率与生长情况一致，都高于野生菌J1
‑
1，敲除菌最高PQQ产量比野生菌J1
‑
1提高11.3％。
附图说明
[0015]图1为线性化质粒及敲除片段回收图，其中M：marker；1：线性化质粒pWM91；2：敲除基因目的片段上游同源臂，大小为1500bp；3：敲除基因目的片段抗性片段，大小为750bp；4：敲除基因目的片段下游同源臂，大小为1500bp。
[0016]图2为敲除质粒菌落PCR图，其中：M：marker；1：单菌落为模板。
[0017]图3为敲除质粒酶切验证图，其中：M：marker；1：敲除质粒双酶切图。
[0018]图4为J1
‑
1Δmpq
‑
0782
‑
0783电转化平板。
[0019]图5为敲除菌种PCR验证，其中：M：marker；1
‑
3：3个单菌落为模板。
[0020]图6为敲除菌株抗性筛选结果。
[0021]图7为J1
‑
1Δmpq
‑
0782
‑
0783锚定验证，其中：M：marker；1：野生型J1
‑
1锚定PCR对照；2：TCS3基因敲除菌株锚定PCR验证。
[0022]图8为野生菌J1
‑
1及敲除菌J1
‑1△
mpq
‑
0782
‑
0783表型测定，其中：(a)生长曲线；(b)：PQQ产量曲线。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0024]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]下述实施例中的甲基营养菌J1
‑
1(中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC4096)、大肠杆菌λ感受态(上海唯地生物技术有限公司)、pWM91质粒及pBBR1MCS
‑
5质粒(武汉淼灵生物科技有限公司)。
[0026]下述实施例中的溶剂CaCl2‑
甘油溶液的配方为：60mM CaCl2，15％甘油，10mmol/L PIPES，PH 7.0。
[0027]下述实施例中的Trans 2K Plus II DNA Marker、MultiS重组克隆试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自达科为；卡那霉素(简称Kan)40mg/mL、庆大霉素(简称Gm)40mg/mL、Trans Taq HiFi DNA Polymerase(全式金)、限制性内切酶BamH I、Apa I、Xba I和Kpn I、T4 DNA连接酶(TaKaRa)；
[0028]下述实施例中的LB液体培养基的配方为：称取NaCl 10g，酵母提取物5g，蛋白胨10g，溶于800mL ddH2O中，定容到1L。
[0029]下述实施例中的甲基营养菌种子培养基(MP)的配方为：MgSO4·
7H2O 0.2g/L，(NH4)2SO43 g/L，KH2PO41.4 g/L，Na2HPO4·
12H2O 3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备用于生产吡咯喹啉醌的工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：将甲基营养菌的基因组中TCS3替换为筛选标记基因，从而获得用于生产吡咯喹啉醌的工程菌；所述TCS3的序列如序列表中序列1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述筛选标记基因为Gm基因；所述Gm基因的序列为序列表中序列2。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述甲基营养菌为甲基营养菌J1
‑
1。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甲基营养菌J1
‑
1中的TCS3是通过同源重组的方式替换为Gm基因的，上游同源臂的序列如序列表中序列3所示，下游同源臂的序列如序列表中序列4所示。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：向甲基营养菌J1
‑
1中导入重组载体，所述重组载体中含有自5
’
端到3<...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊向华，张惟材，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：