一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法技术

本发明专利技术公开了一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法。将pilA基因的启动子片段P

【技术实现步骤摘要】
一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法。

技术介绍

[0002]黏细菌能够产生结构新颖、种类丰富、作用机制多样的生物活性代谢产物，主要包括：肽类，大环类，芳香族等，在农业、医药等方面具有重要的研究和应用价值。由于绝大多数黏细菌存在聚团生长、菌落生长缓慢、难以形成单菌落等现象使得其很难进行遗传操作，严重阻碍了黏细菌中生物活性代谢产物的开发和利用。黄色黏球菌DK1622具有较好的分散性和较快的生长速度是研究黏细菌生物活性代谢产物异源表达的理想模式菌株。但是现有的敲除方法在构建基因组大片段敲除方面存在筛选强度大、突变体纯化时间长等问题，严重制约了DK1622作为底盘工程菌株的应用。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种黄色黏球菌大片段敲除质粒，即利用其构建黄色黏球菌大片段敲除的方法。本专利技术是基于同源重组技术利用两种不同的正负筛选技术，将DK1622基因组上的目的片段敲除。该方法不但提高了黏细菌突变体的筛选效率，而且缩短了获得突变体的时间。
[0004]本专利技术的第一个目的是提供大片段敲除质粒pBJ116，将pilA基因的启动子片段P
pilA
和sacB基因的ORF片段融合获得P
pilA
‑
SacB的模块，扩增出四环素抗性基因，获得P
tet
‑
TCR模块，将P
pilA
‑
SacB模块和P<br/>tet
‑
TCR模块构建到pBJ113载体的BamHI和XbaI位点，获得质粒pBJ116；
[0005]所述的pilA基因的启动子片段P
pilA
的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的sacB基因的ORF片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，所述的四环素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0006]优选，所述的大片段敲除质粒pBJ116的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供敲除质粒pBJ116在敲除目的片段中的应用。
[0008]优选是大片段敲除质粒pBJ116在敲除黄色黏球菌中目的片段中的应用
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种大片段敲除的方法，设定待敲除基因的上游同源臂和下游同源臂序列，扩增后，将上游同源臂插入质粒pBJ116的P
pilA
‑
SacB模块的前面，将下游同源臂插入质粒pBJ116的P
tet
‑
TCR模块的后面，获得敲除质粒，将敲除质粒转入宿主菌中与待敲除基因发生同源重组，利用卡那霉素正向筛选标记、半乳糖负向筛选标记、四环素正向筛选和蔗糖负向筛选模块，筛选获得敲除待敲除基因的宿主菌。
[0010]优选，所述的宿主菌是黄色黏球菌。
[0011]优选，所述的待敲除基因是Myxochelin A编码基因MXAN_3618。
[0012]优选，具体的步骤为：
[0013]首先构建MXAN_3618基因的上游同源臂MyxA
‑
Up
‑
flank，利用引物MyxA
‑
1和MyxA
‑
2扩增上游同源臂1
‑
2；同时利用引物MyxA
‑
3和MyxA
‑
4扩增上游同源臂3，以上游同源臂1
‑
2和上游同源臂3为模板，利用MyxA
‑
1和MyxA
‑
4引物进行PCR扩增，获得上游同源臂的融合片段MyxA
‑
Up
‑
flank，利用同源重组将这该片段构建到pBJ116质粒的SacI和BamHI位点，获得pBJ116
‑
MyxA(Up)质粒；利用引物MyxA
‑
5和MyxA
‑
6扩增下游同源臂2，利用引物MyxA
‑
7和MyxA
‑
8扩增下游同源臂3
‑
4，以下游同源臂2和下游同源臂3
‑
4为模板，利用MyxA
‑
5和MyxA
‑
8引物进行PCR扩增，获得下游同源臂的融合片段MyxA
‑
Down
‑
flank，利用同源重组将这该片段构建到pBJ116
‑
MyxA(Up)质粒的XbaI和SalI位点，从而获得pBJ116
‑
MyxA敲除质粒；将连接的质粒转化到大肠杆菌中，提取pBJ116
‑
MyxA敲除质粒；
[0014]制得黄色黏球菌DK1622感受态，将pBJ116
‑
MyxA敲除质粒转化到黄色黏球菌DK1622感受态中，利用含卡那霉素的培养基筛选，获得单交换菌株，再利用含半乳糖的培养基筛选双交换菌株，然后用含四环素的培养基筛选，再利用含有蔗糖的培养基筛选，获得基因MXAN_3618敲除的黄色黏球菌；
[0015]引物名称序列(5
’‑3’
)MyxA
‑
1acggccagtgaattcgagctcGCTCGTCCTGAGCGCCGAMyxA
‑
2gtcactcactgCTCTTCGGGGAGGGTGAGCMyxA
‑
3cccgaagagCAGTGAGTGACCCGCAGGCMyxA
‑
4cagcacgggtcttcaggatccCTACTGGGATACTGACTCGGTCGMyxA
‑
5gcgcagggctttatttctagaATGACTGACATCTCTCGGGCCMyxA
‑
6gtcactcactgCTCTTCGGGGAGGGTGAGCMyxA
‑
7cccgaagagCAGTGAGTGACCCGCAGGCMyxA
‑
8cttgcatgcctgcaggtcgacAGCCCACCCGATCTCCCC
[0016]。
[0017]本专利技术第四个目的是提供敲除黄色黏球菌的MyxochelinA编码基因ΔMXAN_3618在降低黄色黏球菌捕食铜绿假单胞菌中的应用。
[0018]本专利技术的质粒pBJ116，其含有卡那霉素正向筛选标记、半乳糖负向筛选标记、四环素正向筛选和蔗糖负向筛选模块，通过两次正负筛选系统，实现黄色黏球菌基因组上大片段的敲除。经试验发现，本专利技术的方法获得的Myxochelin A编码基因ΔMXAN_3618突变体产生铁载体的水平显著降低，并且捕食铜绿假单胞菌的能力显著降低。并且该方法所需的时间较短。
附图说明
[0019]图1是pBJ116敲除系统构建的示意图。(A)pBJ116构建；(B)ΔMXAN_36本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大片段敲除质粒pBJ116，其特征在于，是将pilA基因的启动子片段P
pilA
和sacB基因的ORF片段融合获得P
pilA
‑
SacB的模块，扩增出四环素抗性基因，获得P
tet
‑
TCR模块，将P
pilA
‑
SacB模块和P
tet
‑
TCR模块构建到pBJ113载体的BamHI和XbaI位点，获得质粒pBJ116；所述的pilA基因的启动子片段P
pilA
的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的sacB基因的ORF片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的四环素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1的大片段敲除质粒pBJ116，其特征在于，所述的大片段敲除质粒pBJ116的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.权利要求1或2所述的大片段敲除质粒pBJ116在敲除目的片段中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，大片段敲除质粒pBJ116在敲除黄色黏球菌中目的片段中的应用。5.一种大片段敲除的方法，其特征在于，设定待敲除基因的上游同源臂和下游同源臂序列，扩增后，将上游同源臂插入质粒pBJ116的P
pilA
‑
SacB模块的前面，将下游同源臂插入质粒pBJ116的P
tet
‑
TCR模块的后面，获得敲除质粒，将敲除质粒转入宿主菌中与待敲除基因发生同源重组，利用卡那霉素正向筛选标记、半乳糖负向筛选标记、四环素正向筛选和蔗糖负向筛选模块，筛选获得敲除待敲除基因的宿主菌。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌是黄色黏球菌。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的待敲除基因是MyxochelinA编码基因MXAN_3618。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，具体的步骤为：构建MXAN_3618基因的上游同源臂MyxA
‑
Up
‑
flank，利用引物MyxA

【专利技术属性】
技术研发人员：董义杰，朱红惠，董红红，冯广达，姚青，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：