本发明专利技术提供了一种用于合成咖啡酸的构建体，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的苯丙氨酸酶基因、肉桂酸
【技术实现步骤摘要】
ID NO.5所示，肉桂酸
‑4‑
羟化酶基因序列如SEQ ID NO.6所示，对香豆酸
‑3‑
羟化酶基因序列如SEQ ID NO.7所示。
[0008]可选地，其包含有处于所述在蓝细菌中具有活性的启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。
[0009]可选地，所述标记基因为壮观霉素抗性基因片段，所述壮观霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]可选地，其在两端具有集胞藻PCC6803的slr2081基因的N
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末端序列和C
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末端序列，以用于同源重组。
[0011]可选地，在所述蓝细菌中具有活性的所述启动子为Pcpc560。
[0012]可选地，所述蓝细菌为集胞藻PCC6803。
[0013]一种载体，其包含上述任一所述的用于合成咖啡酸的构建体。
[0014]一种蓝细菌，用上述所述的载体转化得到。
[0015]用上述载体转化的蓝细菌。
[0016]一种蓝细菌，其包含上述任一所述的用于合成咖啡酸的构建体。
[0017]一种在蓝细菌中生产咖啡酸的方法，所述方法包括：在合适于合成咖啡酸的条件下培养上述任一的蓝细菌；以及从所获得的培养物中提取所述的咖啡酸。
[0018]本专利技术与现有技术的不同之处在于：
[0019](1)以蓝藻为底盘生物进行改造合成咖啡酸，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，不需要大量用电，因此相较于化学生产方法，生产成本大幅度降低；相对于外加对香豆酸合成咖啡酸的生物合成方法，成本也大幅降低。
[0020](2)以改造微生物为技术基础，在微生物体内进行生物酶的催化合成，避免大规模的提取、分离、纯化过程，从生产成本和对环境友好方面容易控制。
[0021](4)本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序，产品纯化工艺简单，产品质量比一般方法纯度更好、含量更高。
[0022](5)合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产，本专利技术工艺从经济、环境和职业健康角度均为优良的工业化生产路线。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例1中外源基因整合示意图；
[0024]图2为本专利技术实施例1中pJS410质粒图谱；
[0025]图3为本专利技术实施例1中重组载体pJS410
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PAL
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C4H
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REF8质粒图谱；
[0026]图4为本专利技术实施例4中咖啡酸生物合成路线图；
[0027]图5为本专利技术实施例4中咖啡酸生物合成的产量图；
[0028]图6为本专利技术实施例4对照组中野生型集胞藻PCC6803的液相结果图；
[0029]图7为本专利技术中实施例4中转基因蓝藻Syn6803的液相结果图。
具体实施方式
[0030]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业
途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0031]根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本专利技术的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本专利技术的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本专利技术的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本专利技术实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
[0032]为了更好地理解本专利技术而不是限制本专利技术的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本专利技术中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
[0033]本专利技术下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
[0034]本专利技术中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
[0035]本专利技术披露了一种生产咖啡酸的工程蓝藻的制备方法、咖啡酸的合成方法及应用，方法包括在蓝藻细胞里外源表达苯丙氨酸酶(PAL)，肉桂酸
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羟化酶(C4H)和对香豆酸
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羟化酶(REF8)这三个咖啡酸合成关键酶，催化CO2直接生成咖啡酸。主要包括构建集胞藻PCC6803基因表达平台pJS410、重组载体、同源重组、筛选确认以及检测产物五个步骤。利用该合成方式，以蓝藻为底盘生物进行改造合成咖啡酸，生产原料仅需光照和水分等，符合当今绿色生产的方向，且利用该生物手段，与化学提纯方式相比，本专利技术的生产设备和生产环境构建简单，不需要大量用电，生产成本大幅度降低的同时，有效保护了环境，实现了绿色化生产。具体如下各实施例所示。
[0036]实施例1
[0037]本实施例提供载体质粒的构建过程：根据本专利技术提供的Synechocystis sp.PCC6803(简称Syn6803)的slr2081上、下游，Ome和PrbcL基因序列，slr2081上游基因序列见SEQ ID NO.1，slr2081下游基因序列见SEQ ID NO.2，壮观霉素基因序列见SEQ ID NO.3，强启动子PrbcL序列见SEQ ID NO.4，壮观霉素抗性基因和强启动子序列PrbcL链接后插入到slr2081上游基因序列和slr2081下游基因序列之间，载体基本结构如图2所示。按照图2中的质粒图谱构建集胞藻PCC6803基因表达平台pJS410。
[0038]根据PAL，C4H和REF8基因序列，按照Synechocystis sp.PCC6803细胞密码子偏好性设计相应基因的核酸序列。苯丙氨酸酶基因序列(PAL)见SEQ ID NO.5，肉桂酸
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羟化酶基因序列(C4H)见SEQ ID NO.6，对香豆酸
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羟化酶基因序列(REF8)见SEQ ID NO.7。将PAL，C4H和REF8送市面上具有基因合成能力的公司合成，三个基因PAL、C4H、REF8的序列片段插入到表达载体pJS410中，设计具有600bp左右大小的同源臂序列，按照图3中的质粒图谱，利用分子生物学技术将这三个基因整合到pJS410载体上，得到带有壮观霉素抗性基因的重组载体pJS410
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PAL
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C4H
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REF8。本实施例中PAL基因根据红酵母中基因的氨基酸序列进行优化合成；C4H基因根据酵本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于合成咖啡酸的构建体，其特征在于，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的苯丙氨酸酶基因、肉桂酸
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羟化酶基因和对香豆酸
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羟化酶基因三个基因，其中苯丙氨酸酶基因序列如SEQ ID NO.5所示，肉桂酸
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羟化酶基因序列如SEQ ID NO.6所示，对香豆酸
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羟化酶基因序列如SEQ ID NO.7所示。2.根据权利要求1所述的用于合成咖啡酸的构建体，其特征在于：其包含有处于所述在蓝细菌中具有活性的启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。3.根据权利要求2所述的用于合成咖啡酸的构建体，其特征在于：所述标记基因为壮观霉素抗性基因片段，所述壮观霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1所述的用于合成咖啡酸的构建体，其特征在于：其在两端具有集胞藻PCC6803...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱海燕，吴军华，高恶斌，
申请(专利权)人：宁波市妇女儿童医院，
类型：发明
国别省市：
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