肝脏双表型细胞的成熟方法技术

本发明专利技术提供了一种肝脏双表型细胞的成熟方法，以人多能干细胞体外诱导分化产生的肝脏双表型细胞构成的3D类器官为起点，以“3D

【技术实现步骤摘要】
肝脏双表型细胞的成熟方法


[0001]本专利技术涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种肝脏双表型细胞的成熟方法。

技术介绍

[0002]肝脏是人体内再生能力最强的器官之一。对于机械损伤，主要由肝细胞通过自身的复制达到组织修复的目的；而对于酒精性肝损、药物诱导性肝损等生活中更为常见的慢性肝损伤，肝细胞无法对修复做出贡献，肝的再生须依靠肝内胆管上皮细胞实现。近几年的一系列研究证据表明，在慢性肝损状态下，肝内胆管上皮细胞会分化为一种中间态的细胞，其关键特征为：既表达肝祖细胞的标志物，又表达成熟肝细胞的标志物，故被称为肝脏双表型细胞。这种细胞会进一步增殖并分化为肝细胞，进而实现损伤修复。因此，肝脏双表型细胞在慢性损伤修复方面具备重要的应用价值。但至今未见有方法可于体外实现肝脏双表型细胞的成熟。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种肝脏双表型细胞的成熟方法，为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种肝脏双表型细胞的成熟方法，该方法包括如下步骤：S1、将双表型肝细胞构成的3D肝类器官消化为单细胞后将其接种在培养基A中培养得到2D肝前体细胞；S2、将2D肝前体细胞消化为单细胞后再依次接种在培养基A和培养基B中培养得到3D成熟肝类器官；其中，培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：cAMP激活剂、SIRT1抑制剂、TGFβ抑制剂、WNT激活剂、rhFGF10、rhEGF；培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：FH1、FPH1、MK4、OSM和MK125。r/>[0004]进一步，S1的具体步骤为：使用消化酶将类器官消化形成单细胞后，将双表型肝细胞接种于铺有1:50 Matrigel的细胞培养板，连续培养3天，至汇合度达80
‑
90%左右，期间每天更换培养基。
[0005]进一步，S2的具体步骤为：S21、将消化后的单细胞以含30% Matrigel的培养基A重悬单细胞，并接种于超低吸附培养板，连续培养3天，期间不换液；S22、将培养基更换为含10% Matrigel的培养基B继续培养7天，期间每3天换液1次。
[0006]进一步，培养基A的添加组分中，cAMP激活剂为8
‑
Br
‑
cAMP，用量为0.01
‑
1mM；SIRT1抑制剂为NIC，用量为1
‑
10mM；TGFβ抑制剂为A83
‑
01，用量为0.1
‑
10μM；WNT激活剂包括2种，即100
‑
1000ng/ml的rhRSPO1和25
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500ng/ml的rhWnt3a；rhFGF10为50
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500 ng/ml，rhEGF为
50
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500 ng/ml。
[0007]优选地，培养基A中添加组分为：1mM 8
‑
Br
‑
cAMP、10mM NIC、0.5μM A83
‑
01、1μg/ml rhRSPO1、50 ng/ml rhFGF10、50 ng/ml rhEGF、100ng/ml rhWnt3a。
[0008]进一步，培养基A的基础培养基包括0.5% ITS、2% B27、50% William
’
s E、47.5% Ad
‑
F12。
[0009]进一步，培养基B中添加组分为：1
‑
20μM FH1、1
‑
20μM FPH1、2
‑
50μM MK4、5
‑
100ng/ml OSM、0.05
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1μM MK125。
[0010]优选地，培养基B中添加组分为：20μM FH1、20μM FPH1、10μM MK4、20ng/ml OSM、0.5μM MK125。
[0011]进一步，培养基B的基础培养基包括2%KSR、50% HepatoZYME、48% HCM。
[0012]进一步，步骤S1得到的2D肝前体细胞消化后的单细胞可冻存使用。
[0013]本专利技术还提供了一种用于肝脏双表型细胞成熟的试剂盒，包括培养基A和培养基B，培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：cAMP激活剂、SIRT1抑制剂、TGFβ抑制剂、WNT激活剂、rhFGF10、rhEGF；其中，WNT激活剂包括2种，即rhRSPO1和rhWnt3a；cAMP激活剂为8
‑
Br
‑
cAMP；SIRT1抑制剂为NIC；TGFβ抑制剂为A83
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01；培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：FH1、FPH1、MK4、OSM和MK125。
[0014]本专利技术还提供了一种如上所述的试剂盒在诱导肝脏双表型细胞获得成熟肝类器官上的用途。
[0015]相对于现有技术，本专利技术所述的肝脏双表型细胞的成熟方法具有以下优势：本专利提供一种肝脏双表型细胞的成熟方法以人多能干细胞体外诱导分化产生的肝脏双表型细胞构成的3D类器官为起点，以“3D
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2D
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3D”的培养顺序，并配合不同阶段对应的促成熟组合物，共同实现了双表型细胞的体外成熟。并且，消化为单细胞的3D类器官和2D肝前体细胞可批量冻存，经2D复苏后可进一步成熟，可实现产业化。
附图说明
[0016]构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1为培养方案示意图；图2为双表型肝细胞构成的肝类器官明场图；图3为双表型肝细胞的流式细胞术鉴定结果；图4为S1使用培养基A培养前后的细胞明场图；其中，（a）为Day1消化为单细胞接种密度明场图；（b）为Day3细胞明场图；比例尺，200μm；（c）为图（b）的局部放大图；图5为S21培养前后的细胞明场图；其中，（a）为将Day4单细胞明场图；（b）为Day6肝类器官明场图；（c）为Day13肝类器官明场图；图6为S2成熟培养过程中不同时间点荧光定量PCR检测结果；3D
‑
a，双表型肝细胞
构成的类器官（Day1）；2D，肝前体细胞（Day4）；3D
‑
b，成熟肝类器官（Day13）；AL，成年人肝脏；图7为Day13成熟肝类器官的免疫荧光鉴定结果；比例尺，250μm；图8为Day13成熟肝类器官流式分析结果；图9为Day13成熟肝类器官ALB与Urea分泌水平的ELISA检测结果；图10为Day13成熟肝类器官的关键药物代谢酶活性分析结果；图11为Day13成熟肝类器官药物代谢酶可诱导性检测结果；3D
‑
b，成熟肝类器官；PH（Primary hepatocytes），原代肝细胞；RIF（rifampicin），利福平，CYP3A4诱导剂；OMEP（Omeprazole本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝脏双表型细胞的成熟方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：S1、将双表型肝细胞构成的3D肝类器官消化为单细胞后将其接种在培养基A中培养得到2D肝前体细胞；S2、将2D肝前体细胞消化为单细胞后再依次接种在培养基A和培养基B中培养得到3D成熟肝类器官；其中，培养基A包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：cAMP激活剂、SIRT1抑制剂、TGFβ抑制剂、WNT激活剂、rhFGF10、rhEGF；培养基B包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：FH1、FPH1、MK4、OSM和MK125。2.根据权利要求1所述的肝脏双表型细胞的成熟方法，其特征在于：S1的具体步骤为：使用消化酶将类器官消化形成单细胞后，将双表型肝细胞接种于铺有1:50 Matrigel的细胞培养板，连续培养3天，至汇合度达80
‑
90%左右，期间每天更换培养基。3.根据权利要求1所述的肝脏双表型细胞的成熟方法，其特征在于：S2的具体步骤为：S21、将消化后的单细胞以含30% Matrigel的培养基A重悬单细胞，并接种于超低吸附培养板，连续培养3天，期间不换液；S22、将培养基更换为含10% Matrigel的培养基B继续培养7天，期间每3天换液1次。4.根据权利要求1所述的肝脏双表型细胞的成熟方法，其特征在于：培养基A的添加组分中，cAMP激活剂为8
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Br
‑
cAMP，用量为0.01
‑
1mM；SIRT1抑制剂为NIC，用量为1
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10mM；TGFβ抑制剂为A83
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01，用量为0.1
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10μM；WNT激活剂包括2种，即100
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1000...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴迪，徐迎，曹宁，王莉莉，王思思，李慧芳，罗晓琴，
申请(专利权)人：天九再生医学天津科技有限公司，
类型：发明
国别省市：