一种原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法技术

本发明专利技术提供了一种原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法，其中，所述原代汗腺条件细胞培养基包括：细胞基础培养基、血清、Glutamax、缓冲液、细胞培养添加剂、青霉素/链霉素、表皮生长因子、碱性成纤维细胞因子、非必需氨基酸、胰岛素、ROCK抑制剂及NF

【技术实现步骤摘要】
一种原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法


[0001]本专利技术涉及汗腺细胞培养
，特别是涉及一种实现人汗腺细胞体外长期培养扩增的原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法。

技术介绍

[0002]汗腺是皮肤最为重要的附属器官之一，在物质代谢、水电解质平衡以及维持机体内环境稳态等方面具有举足轻重的作用。然而汗腺的再生能力有限，且创伤后皮肤的瘢痕性修复进一步破坏了汗腺的结构和功能，导致皮肤不能正常排汗，体温调节失衡，给患者带来巨大生理及心理伤害。
[0003]当前主要应用生长因子、基因治疗等策略来激活机体原位组织细胞的再生潜能，以实现创伤皮肤的功能性修复。但是大面积烧创伤后创面内残存的汗腺细胞数量不足，再生潜能有限。无法启动创伤修复的级联反应，修复损伤汗腺的结构及功能。因此自体或同种异体汗腺移植成为理想的选择，为解决大面积深度烧创伤患者的康复治疗，恢复其排汗功能带来了新的契机。尽管如此，供体组织来源短缺、原代汗腺获取过程繁杂、汗腺细胞体外增殖能力弱、难以长期扩增培养并维持其生物学特性。这些缺点阻碍了相关技术的进一步临床推广。因此，如何能在体外有效扩增并获得高质量、高纯度的汗腺细胞，以满足大规模临床治疗的需求，是汗腺移植临床应用最为关键的科学问题之一，同时也是研发含汗腺组织工程皮肤必须攻克的难点问题之一。

技术实现思路

[0004]本专利技术实施例提供了一种实现人汗腺细胞体外长期培养扩增的原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法，以解决现有技术中体外分离培养的汗腺细胞增殖能力弱、难以长期扩增培养并维持其生物学特性的问题。
[0005]为了解决上述问题，本申请是这样实现的：
[0006]第一方面，本专利技术实施例提供了一种原代汗腺细胞条件培养基，其中，包括细胞基础培养基、血清、Glutamax、缓冲液、细胞培养添加剂、青霉素/链霉素、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、非必需氨基酸、胰岛素、ROCK抑制剂及NF
‑
κB激动剂。
[0007]可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述NF
‑
κB激动剂为佛波醇12
‑
十四酸酯13
‑
乙酸酯。
[0008]可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，佛波醇12
‑
十四酸酯13
‑
乙酸酯为0.01～0.05μg/mL
[0009]可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述细胞基础培养基为DMEM/F12培养基。
[0010]可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述细胞培养添加剂为B27。
[0011]可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述ROCK抑制剂为Y
‑
33075。
[0012]可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述表皮细胞生长因子的含量为20
～50ng/mL、所述碱性成纤维细胞生长因子的含量为10～20ng/mL、所述Y
‑
33075的含量为0.5～1μM。
[0013]第二方面，本专利技术实施例提供了一种实现人汗腺细胞体外长期培养扩增的条件培养基，其中，包括以下步骤：
[0014]取细胞培养皿，加入如上述的原代汗腺细胞条件培养基；
[0015]将原代汗腺组织加入所述细胞培养皿中，待汗腺组织贴壁后，补加所述原代汗腺细胞条件培养基，且每隔2～3天换液一次；
[0016]在汗腺细胞融合度达到70％
‑
80％时，进行消化传代，获得扩增后的汗腺细胞。
[0017]可选地，所述的方法中，在加入原代汗腺细胞条件培养基的步骤之前，所述方法还包括：
[0018]向所述细胞培养皿中加入胶原蛋白，然后置于CO2培养箱中进行包被处理后吸掉胶原蛋白，并用磷酸缓冲盐溶液清洗。
[0019]可选地，所述的方法中，所述消化传代的过程包括：
[0020]弃掉培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗后加入细胞消化液，置于CO2培养箱中进行消化，待汗腺细胞漂浮时加入上述培养基终止消化；
[0021]将终止消化后的培养液混匀，然后按1:2进行传代，加入包被处理后的细胞培养皿中，再置于CO2培养箱中培养，待汗腺细胞贴壁后利用所述原代汗腺细胞条件培养基进行换液，且每隔2～3天换液一次。
[0022]本专利技术实施例包括以下优点：
[0023]本专利技术实施例中，在原代汗腺细胞条件培养基中添加有表皮生长因子、成纤维细胞因子及ROCK抑制剂，通过表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子、ROCK抑制剂以及NF
‑
κB激动剂的组合对原代汗腺细胞进行处理，以实现人原代汗腺细胞在体外长期扩增培养，并在传代中维持其自身的生物学特性，为快速大量制造高质量的、可移植用人汗腺细胞，满足大规模临床治疗的需求提供了前提条件。
附图说明
[0024]图1为体外扩增第3天后的第一代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
[0025]图2为体外扩增第5天后的第一代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
[0026]图3为体外扩增第15天后的第二代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
[0027]图4为体外扩增第15天后的第二代汗腺细胞形态图，bar＝50um；
[0028]图5为体外扩增第30天后的第三代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
[0029]图6为体外扩增第30天后的第三代汗腺细胞形态图，bar＝50um；
[0030]图7为体外扩增第33天后的第四代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
[0031]图8为体外扩增第40天后的第四代汗腺细胞形态图，bar＝200um；
[0032]图9为不同培养基体外培养10天的原代汗腺细胞β
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半乳糖苷酶染色效果比对图；
[0033]图10为本专利技术实施例培养基体外培养不同时间的原代汗腺细胞β
‑
半乳糖苷酶染色效果对比图；
[0034]图11为原代汗腺细胞的CK5 PCR结果图；
[0035]图12为原代汗腺细胞的CK18 PCR结果图。
具体实施方式
[0036]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。
[0037]本专利技术实施例所提供的原代汗腺细胞条件培养基，包括细胞基础培养基、血清、谷氨酰胺添加剂(Glutamax)、缓冲液、细胞培养添加剂、青霉素/链霉素双抗、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、非必需氨基酸、胰岛素ROCK抑制剂及NF
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κB激动剂。
[0038]其中，表皮细胞生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)均可以激活细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号通路，EGF在汗腺的形态发生和内稳态中发挥积极的作用；而FGF调控着上皮组织器官生长发育的各个阶段，作为特定旁分泌介质结合于上皮细胞表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原代汗腺细胞条件培养基，其特征在于，包括细胞基础培养基、血清、Glutamax、缓冲液、细胞培养添加剂、青霉素/链霉素、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、非必需氨基酸、胰岛素、ROCK抑制剂及NF
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κB激动剂。2.根据权利要求1所述的原代汗腺细胞条件培养基，其特征在于，所述NF
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κB激动剂为佛波醇12
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十四酸酯13
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乙酸酯。3.根据权利要求2所述的原代汗腺细胞条件培养基，其特征在于，佛波醇12
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十四酸酯13
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乙酸酯的含量为0.01～0.05μg/mL。4.根据权利要求1所述的原代汗腺条件细胞培养基，其特征在于，所述细胞基础培养基为DMEM/F12培养基。5.根据权利要求1所述的原代汗腺细胞条件培养基，其特征在于，所述细胞培养添加剂为B27。6.根据权利要求1所述的原代汗腺细胞条件培养基，其特征在于，所述ROCK抑制剂为Y
‑
33075。7.根据权利要求6所述的原代汗腺细胞条件培养基，其特征在于，所述表皮细胞生长因子的含量为20～50ng/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：项江兵，孙晓艳，付小兵，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：