一种多谱系肝脏类器官及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种多谱系肝脏类器官及其构建方法和应用，该方法采用特定的培养基，实现内胚层分化到前肠管衍生物，再到肝脏多谱系特化，最后实现肝脏类器官的药代成熟。通过该方法构建肝脏类器官诱导周期短、培养体系相对简单，操作难度比较小，且采用无血清诱导分化体系，被病原微生物污染的风险低。另外，该方法得到的多谱系肝脏类器官可作为高精准度药筛模型。模型。模型。

【技术实现步骤摘要】
一种多谱系肝脏类器官及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种多谱系肝脏类器官及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]肝脏是人体最重要的药物代谢器官，而药物的肝毒是药品下架的主要原因之一。在动物模型中，药物清除率及肝脏毒性的相关性与临床上的结果差异极大；而人原代肝细胞虽然作为药物代谢的金标准，其来源的短缺使其应用大大受限，目前亟需开发一个具备较强代谢功能的体外人源肝脏代谢模型。
[0003]人多能干细胞 (hPSC) 具有增殖能力与多谱系分化潜力；可于体外定向分化为各种体细胞类型。近年来随着再生医学、发育学以及组织工程学的快速发展，世界各地研究者逐步建立了hPSC来源的肠、肝、脑、肾、胃等多种类器官诱导系统；与2D单层细胞相比，这些3D类器官呈现了更复杂的结构，拥有更贴近生理原貌的成熟度与功能性。而hPSC来源的肝类器官系统，被认为具备还原人类肝脏完整功能的潜力，有望成为新一代的高精准度药筛模型。目前，构建肝脏类器官的方法相对较多，但还存在一定的缺陷，限制了肝脏类器官的应用，如体系诱导大于40天周期较长，培养体系复杂，中间阶段需挑取克隆，操作难度大，且依赖动物血清，难以实现大范围应用。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种多谱系肝脏类器官的构建方法，将肠管前部衍物诱导分化为匀质且尺寸均一的多谱系肝前体，并将这些肝前体诱导分化为具备高药代活性的成熟肝类器官，适用于高通量药物筛选。
[0005]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种多谱系肝脏类器官的构建方法，该方法包括如下步骤：S1、诱导人多能干细胞分化形成定形内胚层；S2、使用BMP抑制剂、FGF4、WNT信号激活剂诱导定形内胚层分化为前肠管衍生物；S3、将前肠管衍生物消化为单细胞，依次使用TGFβ抑制剂、SIRT1抑制剂、VEGF、FGF2、WNT信号激活剂、EGF组合物与RAR核受体激动剂、SIRT1抑制剂、石胆酸LCA组合物，使前肠管单细胞增殖、分化为匀质且尺寸均一的多谱系肝类器官；S4、使用MST1/2的抑制剂、α1
‑
肾上腺素能受体激动剂、甲萘醌4 MK4、 cAMP激活剂、地塞米松MK125组合物实现多谱系肝类器官的药代成熟化。
[0006]进一步，在步骤S2中，所述BMP抑制剂为CC、Noggin或LDN193189中的任一种，所述WNT信号激活剂为CHIR99021或Wnt3a；优选地，所述BMP抑制剂为CC，用量为0.75μM；所述FGF4的浓度为250ng/ml；所述WNT信号激活剂为CHIR99021，用量为3μM。
[0007]进一步，在步骤S2中所用的培养基中包括2% Knockout血清替代物KSR、0.5%胰岛
素
‑
转铁蛋白
‑
硒混合液ITS、75%William's E和22.5% Ham营养混合物F12。
[0008]进一步，在步骤S3中，所述TGFβ抑制剂为RepSox、A83
‑
01或SB431542中的任一种，所述SIRT1抑制剂为NIC，所述WNT信号激活剂为Wnt3a或CHIR99021，所述RAR核受体激动剂为全反式维甲酸ATRA；优选地，所述TGFβ抑制剂为RepSox，用量为1μM；所述NIC的用量为10mM；所述VEGF的浓度为20ng/ml，FGF2的浓度为20ng/ml，EGF的浓度为20ng/ml；所述WNT信号激活剂为Wnt3a，浓度为50ng/ml；ATRA的用量为2μM，LCA的用量为10μM。
[0009]进一步，在步骤S3中两种培养组合物所用的培养基中包括2% Knockout血清替代物KSR、0.5%胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒混合液ITS、75%William's E和22.5% Ham营养混合物F12。
[0010]进一步，在步骤S4中，所述MST1/2的抑制剂为XMU
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MP
‑
1，所述α1
‑
肾上腺素能受体激动剂为甲氧胺MX，所述cAMP激活剂为8
‑
Br
‑
cAMP；优选地，XMU
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MP
‑
1的用量为5μM，MX的用量为1μM，MK4的用量为10μM，8
‑
Br
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cAMP的用量为1 mM，MK125的用量为0.1μM；还包括25ng/ml rh OSM。
[0011]进一步，在步骤S4中所用的培养基中包括2%KSR、48%William's E和50% HepatoZYME。
[0012]进一步，步骤S1具体包括如下步骤：S11、将人多能干细胞在添加有rhActA、rhBMP4和CHIR99021的RPMI
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1640培养基中培养1d；S12、再将S11步骤中得到的细胞在添加有rhActA、rhFGF2和KSR的RPMI
‑
1640培养基中培养1d；S13、再将S12步骤中得到的细胞在添加有rhActA、rhFGF2和KSR的RPMI
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1640培养基中培养1d；且KSR的浓度大于S12中KSR的浓度。
[0013]具体的，S11中添加剂的浓度为：100 ng/ml rhActA、10 ng/ml rhBMP4、2μM CHIR99021；S12中添加剂的浓度为：100 ng/ml rhActA、10ng/ml rhFGF2、0.2% KSR；S13中添加剂的浓度为：100 ng/ml rhActA、10ng/ml rhFGF2、2% KSR。
[0014]进一步，在步骤S2的培养天数为4d，在步骤S3的培养天数为9d，在步骤S4的培养天数为8d。
[0015]进一步，将步骤S2得到的前肠管衍生物消化为单细胞可作为肝类器官的二级种子细胞，支持冻存与复苏。
[0016]进一步，在步骤S3中，将前肠管衍生物消化为单细胞的方法包括以下步骤：1）使用Accutase
‑
EDTA消化酶溶液对前肠管衍生物进行2
‑
5min消化；待其形成单细胞后，以2倍体积的中和培养基中和消化酶，中和培养基包括2%KSR、0.5%ITS、75%William's E和22.5%F12；2）中和消化反应后，在室温250g离心5min，弃去上清后，使用冰上融化的Matrigel基质胶重悬，并包被于超低吸附培养板中，待基质胶凝固后，加入后续诱导培养基中进行培养。
[0017]本专利技术还提供了一种由上述任一项所述的方法构建的多谱系肝脏类器官，所述多谱系肝脏类器官具有以下特征：1）形态匀质、尺寸匀一，大小为150
‑
200μm的球形结构；2）产
物包含肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞、肝巨噬细胞；3）高表达关键药物代谢酶CYP3A4与多药耐药基因MDR1。
[0018]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：S1、诱导人多能干细胞分化形成定形内胚层；S2、使用BMP抑制剂、FGF4、WNT信号激活剂诱导定形内胚层分化为前肠管衍生物；S3、将前肠管衍生物消化为单细胞，依次使用TGFβ抑制剂、SIRT1抑制剂、VEGF、FGF2、WNT信号激活剂、EGF组合物与RAR核受体激动剂、SIRT1抑制剂、石胆酸LCA组合物，使前肠管单细胞增殖、分化为匀质且尺寸均一的多谱系肝类器官；S4、使用 MST1/2的抑制剂、α1
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肾上腺素能受体激动剂、甲萘醌4 MK4、 cAMP激活剂、地塞米松MK125组合物实现多谱系肝类器官的药代成熟化。2.根据权利要求1所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：在步骤S2中，所述BMP抑制剂为CC、Noggin或LDN193189中的任一种，所述WNT信号激活剂为CHIR99021或Wnt3a。3.根据权利要求1所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：在步骤S3中，所述TGFβ抑制剂为RepSox、A83
‑
01或SB431542中的任一种，所述SIRT1抑制剂为NIC，所述WNT信号激活剂为Wnt3a或CHIR99021，所述RAR核受体激动剂为全反式维甲酸ATRA。4.根据权利要求1所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：在步骤S4中，所述MST1/2的抑制剂为XMU
‑
MP
‑
1，所述α1
‑
肾上腺素能受体激动剂为甲氧胺MX，所述cAMP激活剂为8
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Br
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cAMP。5.根据权利要求1所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：步骤S1具体包括如下步骤：S11、将人多能干细胞在添加有rhActA、rhBMP4和CHIR99021的RPMI
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1640培养基中培养1d；S12、再将S11步骤中得到的细胞在添加有rhActA、rhFGF2和KSR的RPMI
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1640培养基中培养1d；S13、再将S12步骤中得到的细胞在添加有rhActA、rhFGF2和KSR的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴迪，葛啸虎，曹宁，王莉莉，徐迎，王思思，李慧芳，罗晓琴，
申请(专利权)人：天九再生医学天津科技有限公司，
类型：发明
国别省市：