一种浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的建立方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的建立方法及其在胶原蛋白合成中的应用，包括如下步骤：S1、通过原代和传代培养建立浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系，目前已传至50代；S2、用TGF

【技术实现步骤摘要】
一种浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的建立方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的建立方法及应用。

技术介绍

[0002]鱼胶(鱼鳔干制品)又称花胶，富含胶质，自古以来就是名贵补品，素有“海洋人参”之誉。浅色黄姑鱼是属于石首鱼科黄姑鱼属的一种肉食性鱼类。因其肉质鲜嫩，味道鲜美，尤其是其鱼胶(白花胶)具有有很高的营养及药用价值，属于四大名胶之一(优质鱼胶价格在10000
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15000元/公斤)，具有极高经济价值和养殖前景。近年来随着国民生活水平不断提高，越来越多的人开始注重养生，鱼胶作为一种理想的高蛋白低脂肪食品受到消费者喜爱，需求量不断增加，市场规模也持续扩大。
[0003]胶原蛋白是鱼胶的主要组成成分和品质的评价指标，探索鱼鳔胶原蛋白合成机制，对于生产高质量鱼鳔产品具有重要意义。浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的建立不仅是研究胶原蛋白合成调控理想的体外模型，也可以应用到浅色黄姑鱼免疫学、毒理学、活性物质检测、细胞生物学及鱼类资源保护等方面的研究中。目前，仅有极少数鱼类(草鱼、金鱼和石斑鱼)有关于鱼鳔细胞系应用于病理研究的相关报道，还未有浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系以及利用鱼鳔细胞系进行胶原蛋白合成机制相关研究的成功报道。

技术实现思路

[0004]浅色黄姑鱼作为生产鱼胶的特种鱼类，其鱼鳔的经济价值要远高于已报道的有鱼鳔细胞系的少数鱼种。然而，目前尚未有浅色黄姑鱼细胞系的报道，也没有利用鱼鳔细胞系在进行胶原蛋白合成调控研究的应用报道。因此建立浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系作为研究胶原蛋白合成机制、鱼鳔营养调控的体外模型是非常有必要的，也是本专利技术的目的，可以填补相关领域的空白。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的应用，用于探究胶原蛋白合成机制、高品质鱼胶生产营养调控，包括如下步骤：
[0007]S1、将通过建立浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系得到的浅色黄姑鱼鱼鳔第25代细胞接种于12孔板，待细胞生长密度达45％～55％，进入S2；
[0008]S2、用TGF
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β试剂孵育细胞，48小时后，收集细胞，对基因表达量及胶原含量进行检测。
[0009]浅色黄姑鱼是生产名贵鱼鳔的特色品种，本专利技术将鱼鳔细胞首次用于胶原蛋白合成相关研究。
[0010]一种上述浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的建立方法，包括如下步骤：
[0011]A、制备完全培养基；
[0012]B、原代细胞培养：浅色黄姑鱼在消毒海水中暂养，之后麻醉、消毒并解剖，取出鱼
鳔组织并洗涤，在含5％胎牛血清的DMEM/F12培养基中剪碎成碎片，一并转移离心，获得组织块，用DMEM/F12培养基清洗后进行接种于表面用 0.5ml所述完全培养基润湿且已包被0.1％明胶的培养瓶，正置培养6
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8小时后加入所述完全培养基，注意不要将组织块吹起，24小时候增添所述完全培养基，置于恒温培养箱中培养，定期用所述完全培养基更换旧培养基，培养14天后得到原代细胞；
[0013]先加入少量培养基让组织块贴壁，再加入剩余培养基进行培养，可以减少组织块悬浮，提高细胞培养的成功率。观察组织块，看组织块是否贴壁已确定培养时间。
[0014]C、细胞传代培养：待细胞铺满单层后，吸去旧培养基，清洗后加入胰酶消化细胞，在显微镜下观察到细胞变圆时，加入所述完全培养基终止消化，轻柔吹打细胞，使其脱落完全，将细胞悬液离心除去培养基后，加入所述完全培养基重悬细胞，1:2传代，增添所述完全培养基，置于恒温培养箱中培养，4
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6天 (细胞在细胞瓶中基本长满就可进行传代)传一次；
[0015]D、第10代后的传代培养：从第10代开始，1:2传代，增添的培养基置于恒温培养箱中培养，4
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6天传一次，形成所述浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系。
[0016]优选的，包括如下步骤：
[0017]A、制备所述完全培养基；
[0018]B、原代细胞培养：浅色黄姑鱼在青霉素浓度为1000IU/ml，链霉素浓度为 1000μg/ml的消毒海水中暂养20～30小时，之后丁香酚麻醉，至于70％的酒精中消毒2分钟，在超净台进行解剖，取出鱼鳔组织后，用含抗生素的磷酸盐缓冲液洗涤三次，在含5％胎牛血清的DMEM/F12培养基中剪碎成1mm3的碎片，一并转移至离心管，加入磷酸盐缓冲液，800rpm下离心，获得组织块，用 DMEM/F12培养基清洗2次后进行接种于表面用0.5ml所述完全培养基润湿且已包被0.1％明胶的T25培养瓶，正置培养6小时后加入所述完全培养基1ml，注意不要将组织块吹起，24小时候增添所述完全培养基3ml，置于27℃恒温培养箱中培养，每3天更换旧培养基，培养14天后得到生长至90％左右原代细胞；
[0019]C、细胞传代培养：待细胞铺满单层后，用吸管吸去旧培养基，加入2ml PBS 轻轻晃动清洗一遍，之后加入1ml溶解在EDTA中的0.25％的胰酶消化细胞，在显微镜下观察到细胞变圆时，加入4ml所述完全培养基终止消化，轻柔吹打细胞，使其脱落完全，将细胞悬液转移至离心管，500rpm下离心5分钟，除去培养基后，加入2ml所述完全培养基重悬细胞，1:2传代，增添4ml所述完全培养基，置于27℃恒温培养箱中培养，5天传一次；
[0020]D、第10代后的传代培养：从第10代开始，1:2传代，增添的培养基为含 15％胎牛血清的DMEM/F12培养基，同时不含生长因子(碱性成纤维生长因子、胰岛素样生长因子及表皮生长因子)，pH为7.0～7.4，置于恒温培养箱中培养， 5天传一次，形成所述浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系。
[0021]细胞系的建立难点在于，细胞系的建立与鱼的品种和组织有关，不同鱼、甚至同一种鱼不同组织的细胞具备不同的性质，需要特定的条件下才能保持其活性并成功完成传代。适用于一种鱼的细胞系建立方法，并不一定适用另外一种，同时有些组织甚至完全无法传代、无法建立细胞系。
[0022]因为在培养至10代后，细胞生长趋于稳定，发现15％血清浓度对细胞生长没有影响，可以降低血清浓度从而降低细胞培养的成本。
[0023]优选的，步骤B中，麻醉所用丁香酚与浅色黄姑鱼的比重为1:10000。
[0024]优选的，制备所述完全培养基包括如下步骤：取DMEM/F12培养基，加入占培养基总体积20％的胎牛血清，20ng/ml的碱性成纤维生长因子，40ng/ml 的胰岛素样生长因子，20ng/ml的表皮生长因子，100IU/ml青霉素，100μg/ml 链霉素，制成所述完全培养基。
[0025]优选的，所述DMEM/F12培养基中，DMEM：F12＝1:1。
[0026]优选的，还包括如下步骤：
[0027]E、细胞冻存及复苏：收集胰酶消化后的细胞悬液，离心除去培养基后，加入预冷的冻存液重悬细胞，在冰箱中冷冻过夜，再移入液氮中长期保存，完成细胞冻存；从液氮中取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的应用，其特征在于，做为用于探究胶原蛋白合成机制、高品质鱼胶生产及营养调控的体外模型，包括如下步骤：S1、通过组织块法进行原代细胞培养，并进行传代培养，得到浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系，进入S2；S2、用TGF
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β试剂孵育细胞，48小时后，收集细胞，检测胶原蛋白相关基因表达量及胶原蛋白含量的变化。2.根据权利要求1所述浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的应用，其特征在于，所述TGF
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β试剂中，TGF
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β的终浓度为10ng/ml。3.一种根据权利要求1所述浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：A、制备完全培养基；B、原代细胞培养：浅色黄姑鱼在消毒海水中暂养，之后麻醉、消毒并解剖，取出鱼鳔组织并洗涤，在含5％胎牛血清的DMEM/F12培养基中剪碎成碎片，一并转移离心，获得组织块，用DMEM/F12培养基清洗后进行接种于表面用0.5ml所述完全培养基润湿且已包被0.1％明胶的培养瓶，正置培养6
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8小时后加入所述完全培养基，注意不要将组织块吹起，24小时候增添所述完全培养基，置于恒温培养箱中培养，定期用所述完全培养基更换旧培养基，培养14天后得到可传代的原代细胞；C、细胞传代培养：待细胞铺满单层后，吸去旧培养基，清洗后加入胰酶消化细胞，在显微镜下观察到细胞变圆时，加入所述完全培养基终止消化，轻柔吹打细胞，使其脱落完全，将细胞悬液离心除去培养基后，加入所述完全培养基重悬细胞，1:2传代，增添所述完全培养基，置于恒温培养箱中培养，4
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6天传一次；D、第10代后的传代培养：从第10代开始，1:2传代，增添的培养基，置于恒温培养箱中培养，4
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6天传一次，形成所述浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系。4.根据权利要求3所述建立方法，其特征在于，包括如下步骤：A、制备所述完全培养基；B、原代细胞培养：浅色黄姑鱼在青霉素浓度为1000IU/ml，链霉素浓度为1000μg/ml的消毒海水中暂养20～30小时，之后丁香酚麻醉，至于70％的酒精中消毒2分钟，在超净台进行解剖，取出鱼鳔组织后，用含抗生素的磷酸盐缓冲液洗涤三次，在含5％胎牛血清的DMEM/F12培养基中剪碎成1mm3的碎片，一并转移至离心管，加入磷酸盐缓冲液，800rpm下离心，获得组织块，用DMEM/F12培养基清洗2次后进行接种于表面用0.5ml所述完全培养基润湿且已包被0.1％明胶的T25培养瓶，正置培养6小时后加入所述完全培养基1ml，注意不要将组织块吹起，24小时候增添所述完全培养基3ml，置于...

【专利技术属性】
技术研发人员：林帆，袁钰莹，林佳丽，余俊，郭浩棘，张浩然，王树启，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：