人源化转基因动物制造技术

提供了人源化转基因动物。本发明专利技术涉及人源化改造的转基因非人动物，尤其是啮齿类动物，例如转基因小鼠。具体而言，本发明专利技术涉及包含人白介素17A(IL

【技术实现步骤摘要】
人源化转基因动物
[0001]本申请是申请日为2020年01月17日，申请号为202010052686.4，专利技术名称为“人源化转基因动物”的中国专利技术专利申请的分案申请。
[0002]本申请要求于2019年01月17日递交的申请号为CN 201910044180.6，专利技术名称为“人源化转基因动物”的中国专利申请的优先权，以及2019年07月09日递交的申请号为CN 201910616231.8，专利技术名称为“人源化转基因动物”的中国专利申请的优先权，在此全文引用上述中国专利申请公开的内容以作为本申请的一部分。

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[0003]本专利技术涉及基因工程领域，具体人源化改造的转基因非人动物，尤其是啮齿类动物，例如转基因小鼠。具体而言，本专利技术涉及包含人白介素17A(IL
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17A)基因、人基因17RA(IL
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17RA)和/或人TNF
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α基因的序列的转基因小鼠，其制备方法和用途。
技术背景：
[0004]白细胞介素(interleukin,IL)17细胞因子(简称“IL
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17”或“IL
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17”)家族是一类特征性细胞因子，主要由活化的T细胞分泌。IL
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17家族目前已经发现了6个成员，分别是IL
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17A、IL
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17B、IL
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17C、IL
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17D、IL
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17E(又称IL
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>25)和IL
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17F。IL
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17受体(简称“IL
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17R”或“IL
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17R”)也形成了一个独特的家族，目前发现了5个同源亚基，分别是IL
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17RA、IL
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17RB、IL
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17RC、IL
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17RD、IL
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17RE。IL
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17通过与受体结合，启动其下游信号通路(包括MAP激酶途径、NF
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kB途径、mRNA稳定信号途径、ERK信号途径以及JAK/STAT信号途径等)，刺激多种细胞产生炎症介质，已成为免疫和炎性疾病的关键参与因子，并可导致器官特异性或全身性自身免疫疾病。
[0005]大量的研究已经证实多种自身免疫性疾病有着高水平的IL
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17表达(如多发性硬化、哮喘、炎症性肠病、银屑病、和类风湿性关节炎等)。此外，IL
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17还与多种自身免疫性疾病的发生发展密切相关，包括克罗恩病，白塞病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、多发性硬化、心肌炎、I型糖尿病、甲状腺炎、特异性皮炎、超敏反应、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、银屑病等。此外，IL
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17还在多种肿瘤组织中表达。IL
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17具有与TNF
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α、LTα、IFNγ和IL
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1β等细胞因子协同扩大炎症的生物学效应。IL
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17和IL
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17R缺乏导致过敏原特异性免疫反应和自身免疫性炎症反应减少。通过特异性抗体阻断IL
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17的体内生物学活性，在临床中已经表现出显著的效果。目前美国FDA已经批准三款靶向人IL
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17/IL
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17R相关抗体，包括IL
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17A单抗Secukinumab、Ixekizumab和IL
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17RA单抗Brodalumab，适应症主要是中重度斑块状银屑病。然而，这些药物存在明显的副作用，比如感染、腹泻等，以及Brodalumab与患者自杀倾向相关。更多靶向该信号通路的新型药物正在或已经进入临床研究。考虑到现有治疗自身免疫性疾病的药物大多只能改善疾病症状，远不能充分满足临床需求，仍需要开发更多靶向IL
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17/IL
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17R的药物。
[0006]实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。由于人IL
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17及其受体家族的氨基酸序列与啮齿类动物中的对
应蛋白存在显著差异，如人IL
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17A和小鼠IL
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17A蛋白序列的一致性仅为60％，因此，识别人IL
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17A蛋白的抗体通常无法识别小鼠IL
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17A，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向IL
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17/IL
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17R信号通路药物的药效。鉴于IL
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17/IL
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17R在疾病发生过程中的广泛参与性和靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化IL
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17/IL
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17R信号通路相关的非人动物模型。

技术实现思路

[0007]除非特别说明，本专利技术的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual,2ndEd.,ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989)；DNA Cloning,Volumes I and II(D.N.Glovered.,1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.,1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon，eds.
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in
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chief,Academic Press,Inc.,New York),Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185,
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Gene Expression Technology
″
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人IL
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17RA基因的序列，任选其中所述人IL
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17RA基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列，任选其中人IL
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17RA基因的外显子1
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11中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或全部11个的序列全部或部分替换所述动物的基因组中对应的内源性序列，任选其中所述人IL
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17RA基因的序列包含人IL
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17RA基因的编码序列，任选其中所述人IL
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17RA基因的序列包含人IL
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17RA基因自2号外显子至11号外显子的序列。2.如权利要求1所述的细胞，其中所述人IL
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17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:35组成。3.如权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞表达人IL
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17RA蛋白或人源化IL
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17RA蛋白，任选其中所述人IL
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17RA蛋白包含与SEQ ID NO:32具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32或由SEQ ID NO:32组成；所述人源化IL
‑
17RA蛋白包含与SEQ ID NO:32第49
‑
341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32第49
‑
341位所示的氨基酸序列；或所述人源化IL
‑
17RA蛋白包含与SEQ ID NO:39具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:39或由SEQ ID NO:39组成。4.如权利要求1
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3中任一项所述的细胞，其中所述人IL
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17RA的序列包含人IL
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17RA基因自2号外显子至11号外显子的序列的全部或部分，任选其中所述人IL
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17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:31具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列；任选其中所述人IL
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17RA基因的序列包含SEQ ID NO:31或由SEQ ID NO:31组成。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人TNF
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α基因的序列，其中所述人TNF
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α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。6.如权利要求5所述的细胞，其中所述人TNF
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α基因的序列包含人TNF
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α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。7.如权利要求5所述的细胞，其中所述人TNF
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α基因的序列包含与SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:61组成。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达人TNF
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α蛋白，任选其中所述人TNF
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α蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:58或由SEQ ID NO:58组成。9.如权利要求1至8中任一项所述的细胞，其中所述转基因非人动物细胞是转基因啮齿
类动物细胞或转基因小鼠细胞。10.如权利要求1至9中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自体细胞和干细胞例如胚胎干细胞。11.如或权利要求1至10中任一项所述的细胞在筛选调节IL
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17A/IL
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17
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RA信号通路的试剂中的用途，任选地所述试剂选自抗体、抗体片段、对应受体或配体或其片段、融合蛋白和小分子化合物。12.一种重组载体，所述重组载体包含人IL
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17RA基因的编码序列或自2号外显子至11号外显子的序列和小鼠IL
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17RA基因上游和下游同源臂序列。13.如权利要求12所述的重组载体，其中所述人IL
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17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:35组成。14.如权利要求12或13所述的重组载体，其中所述小鼠IL
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17RA基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100
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500个核苷酸，500
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1000个核苷酸，1000
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2000个核苷酸，2000
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3000个核苷酸，3000
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5000个核苷酸或者5000
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10000个核苷酸，优选所述小鼠IL
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17RA基因上游和下游同源臂序列各自包含3000
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5000个核苷酸。15.如权利要求12或13所述的重组载体，其中所述小鼠IL
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17RA基因上游同源臂序列包含SEQ ID NO:33，且所述下游同源臂序列包含SEQ ID NO:34。16.如权利要求12至115中任一项所述的重组载体，其中所述重组载体还包含用于阳性筛选的抗性基因，例...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，郭朝设，郭雅南，白阳，黄蕤，赵磊，周小飞，张美玲，姚佳维，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：