具有组合基因修饰的工程化细胞的生产和跟踪制造技术

本文描述了通过将基因变体(设计的或随机的)或构建体(基因或其他任意的DNA)的组合引入细胞群来制造基因修饰的细胞以及通过在称为条形码基因座的公共基因座(染色体或质粒)处顺序构建条形码阵列来跟踪每个变体组合的方法。还描述了通过这些方法制成的细胞。方法。还描述了通过这些方法制成的细胞。方法。还描述了通过这些方法制成的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有组合基因修饰的工程化细胞的生产和跟踪
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年2月8日提交的美国临时申请号62/803,242的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
[0003]有关联邦资助的研究或发展的声明
[0004]本专利技术是在美国国家卫生研究院授予的合同HG000205和美国国家标准与技术研究院授予的合同70NANB15H268的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。

技术介绍

[0005]揭露复杂表型的基因基础以及工程化具有期望性质的生物系统是数量遗传学和合成生物学中的核心挑战。为了实现这些目标，需要能够并行测试许多不同的基因变体和途径的功能输出的技术。DNA合成的最新进展已使得能够很容易地构建CRISPR引导文库、配对的引导RNA供体DNA文库和基因变体文库，从而使得能够生成大池的基因变体。虽然存在在多重测试中跟踪此类单个变体的方法，其中每个细胞具有单个扰动，但是当前几乎没有可用于以混合格式产生和跟踪基因变体的更高阶组合的可扩展的方法。此类技术对于了解变体如何相互作用以调整表型来说至关重要。
[0006]因此，仍然需要更有效、灵活和可扩展的在单个细胞中产生和跟踪任意数量的基因改变的方法。

技术实现思路

[0007]本公开涉及一种用于将基因变体(设计的或随机的)或构建体(基因或其他任意的DNA)的组合引入细胞群以及通过在称为条形码基因座的公共基因座(染色体或质粒)处顺序构建条形码阵列来跟踪每个变体组合的方法。每个变体、基因构建体或基因修饰由所述阵列内的独特条形码表示，使得条形码阵列的DNA测序使得能够通过基于测序的计数来跟踪群内每个变体组合的丰度。重要的是，本文描述的方法不限于与CRISPR介导的基因组编辑的关联，并且对于产生设计或随机的基因变化的任何基因修饰过程或对于在DNA中存储和压缩任意数字信息来说具有更广泛的应用。
[0008]在一个方面，本公开涉及一种产生多个基因工程细胞的方法。在实施例中，所述方法包括(a)使多个细胞与第一基因编辑剂和第一多个重组多核苷酸接触，每个重组多核苷酸包含独特的多核苷酸条形码序列，从而形成第一多个基因编辑和条形码化的细胞，每个基因编辑和条形码化的细胞具有插入条形码基因座中的所述第一独特的多核苷酸条形码以及第一独特的基因修饰；以及(b)使所述第一多个基因编辑和条形码化的细胞与第二基因编辑剂和第二多个重组多核苷酸接触，每个重组多核苷酸包含独特的多核苷酸条形码序列，从而形成第二多个基因编辑和条形码化的细胞，每个基因编辑和条形码化的细胞具有插入条形码基因座中的所述第二独特的多核苷酸条形码以及第二独特的基因修饰；从而产生多个基因工程细胞。在实施例中，所述方法包括重复步骤(b)一次或多次，其中步骤(b)的每次重复采用多个重组多核苷酸，使得所述条形码基因座包括具有重组多核苷酸条形码的
独特组合的条形码阵列。
[0009]在一个方面，提供了一种通过下列方式产生多个基因工程细胞的方法：(a)使多个细胞与第一基因编辑剂接触，从而产生各自具有第一独特的基因修饰的第一多个基因编辑细胞；(b)将第一多个重组多核苷酸转染到所述第一多个基因编辑细胞中，每个重组多核苷酸包含第一独特的多核苷酸条形码序列，从而形成第一多个基因编辑和条形码化的细胞，每个基因编辑和条形码化的细胞具有插入条形码基因座的所述第一独特的多核苷酸条形码和所述第一独特的基因修饰；(c)使所述第一多个基因编辑和条形码化的细胞与第二基因编辑剂接触，从而产生各自具有第二独特的基因修饰的第二多个基因编辑细胞；以及(d)将第二多个重组多核苷酸转染到所述第二多个基因编辑细胞中，每个重组多核苷酸包含第二独特的多核苷酸条形码序列，从而形成第二多个基因编辑和条形码化的细胞，使得将第二独特的多核苷酸条形码插入所述第二多个基因编辑和条形码化的细胞中每一个的条形码基因座中，每个基因编辑和条形码化的细胞具有插入条形码基因座中的所述第二独特的多核苷酸条形码和所述第二独特的基因修饰；从而产生多个基因工程细胞。在实施例中，所述方法包括重复步骤(c)和(d)一次或多次，其中步骤(c)和(d)的每次重复采用多个重组多核苷酸，使得所述条形码基因座包括条形码阵列，其包含重组多核苷酸条形码的独特组合。
[0010]在实施例中，所述第一独特的多核苷酸条形码与所述第一多个基因编辑和条形码化的细胞中每一个中的所述第一独特的基因修饰相关联。在实施例中，对所述第一多个基因编辑和条形码化的细胞中每一个的所述条形码基因座和所述基因组的至少一部分进行测序，使得所述第一独特的多核苷酸条形码与数据库中的所述第一独特的基因修饰相关联。
[0011]在实施例中，所述第二独特的多核苷酸条形码与所述第二多个基因编辑和条形码化的细胞中每一个中的所述第二独特的基因修饰相关联。在实施例中，对所述第二多个基因编辑和条形码化的细胞中每一个的所述条形码基因座和所述基因组的至少一部分进行测序，使得所述第二独特的多核苷酸条形码与数据库中的所述第二独特的基因修饰相关联。
[0012]在实施例中，所述方法包括通过对所述条形码基因座进行测序来识别所述多个基因工程细胞中每一个中的基因突变。
[0013]在一个方面，提供了一种产生多个条形码化的细胞的方法。在实施例中，所述方法包括(a)使多个细胞与第一多个重组多核苷酸接触，每个重组多核苷酸包含独特的多核苷酸条形码序列，使得将第一独特的多核苷酸条形码插入所述第一多个细胞中每一个的条形码基因座中，从而形成第一多个条形码化的细胞。在实施例中，所述方法还包括(b)使所述第一多个条形码化的细胞与第二多个重组多核苷酸接触，每个重组多核苷酸包含独特的多核苷酸条形码序列，使得将第二独特的多核苷酸条形码插入所述第一多个基因编辑和条形码化的细胞中每一个的所述条形码基因座中，从而形成第二多个基因编辑和条形码化的细胞。
[0014]在一个方面，提供了一种将多核苷酸信息压缩成细胞内单个条形码的方法。在实施例中，所述方法包括获得细胞，其在条形码基因座(条形码阵列)中具有至少两个独特的多核苷酸条形码；在所述细胞的所述条形码基因座中插入新的独特的多核苷酸条形码；以及对所述条形码基因座进行测序，使得所述新的独特的多核苷酸条形码(压缩器条形码)与
所述至少两个独特的多核苷酸条形码相关联。在实施例中，所述方法还包括从具有留在所述条形码基因座中的所述压缩器条形码的所述细胞的所述条形码基因座去除所述至少两个独特的多核苷酸条形码。此过程可以称为“条形码压缩”。
[0015]在一个方面，提供了通过本文描述的方法制成的多个基因编辑和条形码化的细胞。
[0016]在一个方面，提供了通过本文描述的方法制成的一种基因编辑和条形码化的细胞。
[0017]在实施例中，与所述条形码基因座中所述先前独特的多核苷酸条形码相邻近地添加每个独特的多核苷酸条形码。在实施例中，在所述条形码基因座中所述先前独特的多核苷酸条形码的上游添加每个独特的多核苷酸条形码。在实施例中，在所述条形码基因座中所述先前独特的多核苷酸条形码的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生多个基因工程细胞的方法，所述方法包括：(a)使多个细胞与第一基因编辑剂和第一多个重组多核苷酸接触，每个重组多核苷酸包括独特的多核苷酸条形码序列，从而形成第一多个基因编辑和条形码化的细胞，每个基因编辑和条形码化的细胞包括插入条形码基因座中的所述第一独特的多核苷酸条形码以及第一独特的基因修饰；以及(b)使所述第一多个基因编辑和条形码化的细胞与第二基因编辑剂和第二多个重组多核苷酸接触，每个重组多核苷酸包括独特的多核苷酸条形码序列，从而形成第二多个基因编辑和条形码化的细胞，每个基因编辑和条形码化的细胞包括插入条形码基因座中的所述第二独特的多核苷酸条形码以及第二独特的基因修饰；从而产生多个基因工程细胞。2.一种产生多个基因工程细胞的方法，所述方法包括：(a)使多个细胞与第一基因编辑剂接触，从而产生第一多个基因编辑细胞，其各自包括第一独特的基因修饰；(b)将第一多个重组多核苷酸转染至所述第一多个基因编辑细胞，每个重组多核苷酸包括第一独特的多核苷酸条形码序列，从而形成第一多个基因编辑和条形码化的细胞，每个基因编辑和条形码化的细胞包括插入条形码基因座中的所述第一独特的多核苷酸条形码以及所述第一独特的基因修饰；(c)使所述第一多个基因编辑和条形码化的细胞与第二基因编辑剂接触，从而产生第二多个基因编辑细胞，其各自包括第二独特的基因修饰；以及(d)将第二多个重组多核苷酸转染至所述第二多个基因编辑细胞，每个重组多核苷酸包括第二独特的多核苷酸条形码序列，从而形成第二多个基因编辑和条形码化的细胞，使得第二独特的多核苷酸条形码被插入所述第二多个基因编辑和条形码化的细胞中每一个的条形码基因座中，每个基因编辑和条形码化的细胞包括插入条形码基因座中的所述第二独特的多核苷酸条形码以及所述第二独特的基因修饰；从而产生多个基因工程细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其还包括重复步骤(b)一次或多次，其中步骤(b)的每次重复采用相同或不同的多个重组多核苷酸，每个重组多核苷酸包括独特的多核苷酸条形码序列。4.根据权利要求2所述的方法，其还包括重复步骤(c)和(d)一次或多次，其中步骤(c)和(d)的每次重复采用相同或不同的多个重组多核苷酸，每个重组多核苷酸包括独特的多核苷酸条形码序列。5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一独特的多核苷酸条形码与所述第一多个基因编辑和条形码化的细胞中每一个中的所述第一独特的基因修饰相关联。6.根据权利要求5所述的方法，其中对所述第一多个基因编辑和条形码化的细胞中每一个的所述条形码基因座和所述基因组的至少一部分进行测序，使得所述第一独特的多核苷酸条形码与数据库中的所述第一独特的基因修饰相关联。7.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二独特的多核苷酸条形码与所述第二多个基因编辑和条形码化的细胞中每一个中的所述第二独特的基因修饰相关联。8.根据权利要求7所述的方法，其中对所述第二多个基因编辑和条形码化的细胞中每
一个的所述条形码基因座和所述基因组的至少一部分进行测序，使得所述第二独特的多核苷酸条形码与数据库中的所述第二独特的基因修饰相关联。9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其还包括通过对所述条形码基因座进行测序来识别所述多个基因工程细胞中每一个中的基因突变。10.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述条形码基因座中所述先前独特的多核苷酸条形码相邻近地添加每个独特的多核苷酸条形码。11.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述条形码基因座中所述先前独特的多核苷酸条形码的上游添加每个独特的多核苷酸条形码。12.根据1至10中任一项所述的方法，其中在所述条形码基因座中所述先前独特的多核苷酸条形码的下游添加每个独特的多核苷酸条形码。13.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中每个独特的多核苷酸条形码在所述重组多核苷酸上的侧翼是右同源臂和/或左同源臂。14.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中每个第一独特的多核苷酸条形码在所述第一多个多核苷酸的每个重组多核苷酸上的侧翼是第一右同源臂、第二右同源臂和左同源臂，使得所述第一右同源臂和所述左同源臂与在所述条形码基因座处的序列同源。15.根据权利要求14所述的方法，其中每个第二独特的多核苷酸条形码在所述第二多个多核苷酸的每个重组多核苷酸上的侧翼是所述第二右同源臂、所述左同源臂并且可选的是第三右同源臂，使得在将所述第一独特的多核苷酸条形码整合到所述条形码基因座中之后，所述第二右同源臂和所述左同源臂与在所述条形码基因座处的序列同源。16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述第一多个多核苷酸中的每个重组多核苷酸包括在所述左同源臂和所述第二右同源臂之间的第一标记多核苷酸。17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述第二多个多核苷酸中的每个重组多核苷酸包括在所述左同源臂和所述第三右同源臂之间的第二标记多核苷酸。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述标记多核苷酸被掺入具有所述独特的多核苷酸条形码的所述条形码基因座中。19.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中通过同源重组将每个独特的多核苷酸插入所述条形码基因座中。20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中每个独特的多核苷酸通过非同源末端连接插入所述条形码基因座中。21.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中每个独特的多核苷酸使用整合酶插入所述条形码基因座中。22.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中每个重组多核苷酸还包括标记多核苷酸。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述标记多核苷酸被掺入具有所述独特的多核苷酸条形码的所述条形码基因座中。24.根据权利要求22或23所述的方法，其还包括选择存在所述标记多核苷酸的细胞。25.根据权利要求22或23所述的方法，其还包括选择不存在所述标记多核苷酸的细胞。26.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述第一多个重组多核苷酸中的所述标记多核苷酸不同于所述第二多个重组多核苷酸中的所述标记多核苷酸。
27.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一基因编辑剂是大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(TALEN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统、RNA引导的核酸酶、RNA引导的切口酶、化学试剂、重组酶、整合酶或转座酶。28.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二基因编辑剂是大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(TALEN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统、RNA引导的核酸酶、RNA引导的切口酶、化学试剂、重组酶、整合酶或转座酶。29.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一基因编辑剂和所述第二基因编辑剂相同。30.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述第一基因编辑剂和所述第二基因编辑剂不同。31.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其还包括对源于所述第一多个基因编辑和条形码化的细胞中的细胞的所述染色体的至少一部分进行测序。32.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其还包括对源于所述第二多个基因编辑和条形码化的细胞中的细胞的所述染色体的至少一部分进行测序。33.根据权利要求31或32所述的方法，其中对所述条形码基因座进行测序。34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中至少一个基因修饰是通过测序确定的。35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其还包括用独特的多核苷酸条形码识别至少一个基因修饰。36.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其还包括(i)在每个细胞的所述条形码基因座中插入新的独特的多核苷酸条形码，其中在插入所述新的独特的多核苷酸条形码之前，所述条形码基因座已经包括至少两个独特的多核苷酸条形码，(ii)对所述条形码基因座进行测序，使得所述新的独特的多核苷酸条形码与所述至少两个独特的多核苷酸条形码相关联。37.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：美国政府由商务部长代表，
类型：发明
国别省市：