一种制备拟南芥自噬基因突变体的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种制备拟南芥自噬基因突变体的方法及应用，所述的方法为在野生型拟南芥中，使用CRISPR/Cas9系统沉默ATG8基因的拷贝基因，所述的拷贝基因为ATG8a、ATG8b、ATG8c、ATG8d、ATG8e、ATG8f、ATG8g、ATG8h和ATG8i。所述引用为降低植物营养循环利用。本发明专利技术通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可以在较短时间内达到精确、有效地敲除全部ATG8基因的多突变体，为后续研究ATG8基因家族的功能奠定坚实基础。本发明专利技术还提供了ATG8基因在降低植物营养循环利用方面的应用，为培育营养高效利用的植物新品种提供了新的基因资源，在农业生产上具有重要的应用价值。要的应用价值。要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种制备拟南芥自噬基因突变体的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种制备拟南芥自噬基因突变体的方法。

技术介绍

[0002]细胞自噬(autophagy)是真核生物利用溶酶体或液泡对胞内物质和细胞器进行降解的一种进化保守的重要代谢途径。该途径主要通过双层膜结构将待降解底物包裹后，形成自噬小泡(autophagosome)，当自噬小泡被运输到液泡附近时，其外膜与液泡膜融合，内膜包裹的底物则释放到液泡中，并被水解酶降解成可循环利用的小分子物质。当真核生物面临营养缺乏或者因分化造成的物质供应不足时，细胞会启动自噬来调节胞内物质的循环利用，以保证其各部分功能的正常运行。自噬对植物的正常生长不可或缺，它几乎参与了植物生长发育的各个阶段，包括种子萌发、个体发育、繁殖和衰老等，尤其在植物应对营养胁迫、抵御病原体侵染和调控细胞程序性死亡中发挥着重要作用。当自噬途径受损时，植物会表现出生长缓慢、过早衰老并对营养物质缺乏敏感等的表型。
[0003]自噬途径受到一系列自噬相关基因(AuTophaGy
‑
related genes，简称ATG基因)的精密调控。其中ATG8是自噬途径中的核心蛋白，它通过与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)相连而锚定在自噬小泡的双层膜上，参与了自噬小泡的形成与成熟。ATG8
‑
PE还起着对接平台的作用，与具有ATG8互作基序(ATG8 interacting motif，AIM)的各种衔接蛋白相互作用，选择性地降解各种自噬底物。尽管ATG8在自噬途径中起着重要的作用，但是到目前为止尚未明确其在植物中扮演的具体角色。
[0004]植物中的ATG8是多拷贝基因，在拟南芥中一共有9个拷贝，在玉米中有5个拷贝，在水稻中有6个拷贝。拟南芥的ATG8基因家族成员分别为ATG8a
‑
i，在进化上可以分成三个亚家族ATG8abcd、ATG8efg、ATG8hi。ATG8家族各个拷贝在拟南芥不同组织中均有表达，且不同亚家族的基因表达是特异的。近年来研究表明通过过表达拟南芥自身的ATG8基因，或者在拟南芥中异源过表达ATG8基因，均会引起拟南芥的自噬水平升高，还能够提高植株的生长发育、种子产量和氮素再利用效率，并且增强植株对非生物胁迫的耐受性。除在拟南芥之外，其他作物中ATG8蛋白的功能也逐渐被发现。现有技术通过过表达或敲低水稻OsATG8b的转基因材料进行分析，发现OsATG8b介导的自噬途径参与了氮素向籽粒的营养循环，并且直接影响了籽粒品质。
[0005]由于植物中ATG8家族存在着多个拷贝，一直缺少直接的遗传材料去详细解析ATG8在植物自噬中的功能，尚无以ATG8全拷贝缺失的突变体植株模型以供自噬途径的研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种制备拟南芥自噬基因ATG8九突变体的方法。
[0007]本专利技术的另一个目的是提供上述制备拟南芥自噬基因ATG8九突变体的方法在制备降低植物营养循环的植物模型方面的应用。
[0008]本专利技术的再一个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID NO：1～9所示的拷贝基因的基
因敲除位点和/或核苷酸序列如SEQ ID NO：10～18所示序列的sgRNA在制备降低植物营养循环利用的拟南芥中的应用。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0010]本专利技术提供了一种创建ATG8基因九重突变体的基因编辑载体的构建方法，包括：
[0011](1)首先通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建atg8efg三突变体纯合株系；
[0012](2)然后以atg8efg三突变体纯合株系为材料，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建atg8abcdefg七突变体纯合株系；
[0013](3)最后以atg8abcdefg七突变体纯合株系为材料，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建atg8abcdefghi九突变体纯合株系。
[0014]本专利技术提供了一种制备拟南芥自噬基因ATG8突变体的方法，在野生型拟南芥中，使用CRISPR/Cas9系统敲除ATG8基因的多拷贝基因，所述的拷贝基因为ATG8a、ATG8b、ATG8c、ATG8d、ATG8e、ATG8f、ATG8g、ATG8h和ATG8i，依次对应TAIR数据库中的Locus为AT4G21980、AT4G04620、AT1G62040、AT2G05630、AT2G45170、AT4G16520、AT3G60640、AT3G06420和AT3G15580。
[0015]优选地，所述的拷贝基因的基因敲除sgRNA靶向位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～9所示。
[0016]更优选地，靶向所述的基因敲除sgRNA靶向位点的sgRNA的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10～18所示。
[0017]优选地，所述的方法包含以下步骤：
[0018]S1.使用CRISPR/Cas9系统沉默野生型拟南芥的ATG8基因的ATG8e、ATG8f和ATG8g拷贝基因，得到纯合三突变体株系；
[0019]S2.使用CRISPR/Cas9系统沉默纯合三突变体株系的ATG8基因的ATG8a、ATG8b、ATG8c和ATG8d拷贝基因，得到纯合七突变体株系；
[0020]S3.使用CRISPR/Cas9系统沉默纯合七突变体株系的ATG8基因的ATG8a、ATG8b、ATG8c和ATG8d拷贝基因，得到纯合九突变体株系。
[0021]更优选地，所述制备拟南芥自噬基因ATG8突变体的方法包含以下步骤：
[0022]S1.使用敲除ATG8e、ATG8f和ATG8g拷贝基因的CRISPR/Cas9载体，所述的CRISPR/Cas9载体包含核苷酸序列如SEQ ID NO：10～12所示的sgRNA的编码基因；农杆菌法转化野生型拟南芥，经筛选鉴定，得到无Cas9背景的atg8efg纯合三突变体株系；
[0023]S2.使用敲除ATG8a、ATG8b、ATG8c和ATG8d拷贝基因的CRISPR/Cas9载体，所述的CRISPR/Cas9载体包含核苷酸序列如SEQ ID NO：13～16所示的sgRNA的编码基因；农杆菌法转化atg8efg纯合三突变体株系，经筛选鉴定，得到无Cas9背景的atg8abcdefg纯合七突变体株系；
[0024]S3.使用敲除ATG8h和ATG8i拷贝基因的CRISPR/Cas9载体，所述的CRISPR/Cas9载体包含核苷酸序列如SEQ ID NO：17～18所示的sgRNA的编码基因；农杆菌法转化atg8abcdefg纯合七突变体株系，经筛选鉴定，得到无Cas9背景的atg8abcdefghi纯合九突变体株系。
[0025]更优选地，CRISPR/Cas9载体为pHEE401E载体。
[0026]更优选地，所述筛选为潮霉素筛选。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备拟南芥自噬基因ATG8九突变体的方法，其特征在于，在野生型拟南芥中，使用CRISPR/Cas9系统敲除ATG8基因的多重拷贝基因，所述的拷贝基因为ATG8a、ATG8b、ATG8c、ATG8d、ATG8e、ATG8f、ATG8g、ATG8h和ATG8i，依次对应TAIR数据库中的Locus为AT4G21980、AT4G04620、AT1G62040、AT2G05630、AT2G45170、AT4G16520、AT3G60640、AT3G06420和AT3G15580。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的拷贝基因的基因敲除sgRNA靶向位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～9所示。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，靶向权利要求2所述的基因敲除sgRNA靶向位点的sgRNA的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10～18所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包含以下步骤：S1.使用CRISPR/Cas9系统敲除野生型拟南芥的ATG8基因的ATG8e、ATG8f和ATG8g拷贝基因，得到纯合三突变体株系；S2.使用CRISPR/Cas9系统沉默纯合三突变体株系的ATG8基因的ATG8a、ATG8b、ATG8c和ATG8d拷贝基因，得到纯合七突变体株系；S3.使用CRISPR/Cas9系统沉默纯合七突变体株系的ATG8基因的ATG8h、和ATG8i拷贝基因，得到纯合九突变体株系。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包含以下步骤：S1.使用敲除ATG8e、ATG8f和ATG8g拷贝基因的CRISPR/Cas9载体，所述的CRISPR/Cas9载体包含核苷酸序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓，刘易林，谭慧琼，李发强，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：