一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用。本发明专利技术以烟草脆裂病毒TRV作为VIGS体系的载体，以红葱八氢番茄红素脱氢酶基因作为目的基因，利用真空渗透处理方法成功创建了适合红葱的VIGS沉默体系；将该体系应用于开展红葱色素合成相关基因EbMYB5和EbMYB52基因功能研究，被侵染的沉默处理组样品叶片中EbMYB5、EbMYB52基因表达量显著降低，且与色素合成途径相关的关键基因表达量呈现出不同程度的显著变化，表明本发明专利技术的红葱VIGS沉默体系可以成功应用于红葱基因功能验证。本发明专利技术构建的红葱VIGS沉默体系对于红葱基因功能研究具有重要意义。葱基因功能研究具有重要意义。葱基因功能研究具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]鸢尾科植物红葱(Eleutherine bulbosa(Mill.)Urb.)原产于西印度群岛、美洲等地，后经云南民间引入栽培，发展成为云南、广西等西南地区传统民间药用植物。红葱具有抗菌、消炎等多重功效(Padhi and Panda,2015)，亦可作为野菜食用(潘俊等,2011；王晓艺等,2015；徐巧林等,2014)。鸢尾科红葱与人们熟知的蔬菜葱科葱属植物红葱(香葱)(Allium ascalonicumL.)，在其鳞茎外观、名称均相似，易被混淆。上世纪80年代已经开展了对红葱化学成分和药理活性的研究，目前从红葱中分离得到的化合物主要有萘酚、萘醌、蒽醌及其衍生物、甾体、葡萄糖苷及其他小分子类化合物(Gallo et al.,2010；Han et al.,2008；段文娟等,2016；邱峰等,2005)。红葱其化学成分具有多种药理作用，包括血管舒张、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等一系列的活性(Padhi and Panda,2015；Kamarudin et al.,2020；Nugrohoet al.,2018)。红葱的红色素色泽纯正柔和，作为天然红色素的来源具有广阔的发展前景；其中蒽醌类是提取物红色素的主要成分，可为新型天然红色素的开发供理论依据。红葱提取物应用广泛，在食品加工、功能食品、植物饲料添加剂、功能性化妆品、植物源药品等方面有很好的应用前景(何云等,2014)。
[0003]虽然红葱化学成分及药理活性方面早有研究开展(Jiang et al.,2018；徐晓梅等,2018)，但是关于其分子生物学方面的研究甚少，特别是基因序列信息的匮乏和自身遗传转化体系尚未构建，导致其基因表达分析、功能研究及有效活性成分合成机理等研究相对滞后。病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是一种RNA介导的防御机制，即转录后水平的基因沉默(post
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transcriptional gene silencing,PTGS)，是植物体内普遍存在的遗传免疫机制。该技术利用携带植物功能基因cDNA的病毒，在侵染植物体后可诱导植物发生基因沉默从而引起表型改变，以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能。与转基因等方法相比，VIGS具有简便高效、周期短、可沉默基因家族、不需获取转基因植株、高通量等优点，同时可在不同遗传背景的植物间进行基因功能比较，是研究功能基因组和特定基因功能的有效工具。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用。
[0005]因此，本专利技术的第一个目的是提供一种红葱VIGS沉默体系的构建方法，包括以下步骤：
[0006]a.将红葱目的基因特异性片段连接至pTRV2载体的多克隆位点上，获得pTRV2
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目的基因特异性片段重组质粒，将重组质粒转化农杆菌，获得pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌，培养收集菌体备用；
[0007]b.用缓冲液分别将pTRV1农杆菌、pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌的菌体重悬分散制成农杆菌菌液，然后将pTRV1农杆菌菌液与pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌菌液混合为侵染液；
[0008]c.将红葱植株洗净，吸干表面水分，完全浸泡于侵染液中，进行真空渗透处理；
[0009]d.用无菌水清洗植株上多余的侵染液，然后将植株于20℃下黑暗培养24h，25℃黑暗条件下平衡24h，随后正常培养，构建得到红葱的目的基因VIGS沉默体系。
[0010]优选，所述的缓冲液含有10mM MES、200μM乙酰丁香酮和10mMMgCl2，余量为水，pH 5.6。
[0011]优选，所述的pTRV1农杆菌菌液、pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌菌液的OD600＝1，pTRV1农杆菌菌液与pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌菌液按体积比1：1混合为侵染液。
[0012]优选，所述的用于真空渗透处理的红葱植株为6～8个月生长期的红葱植株。
[0013]优选，所述的真空渗透处理为：于真空渗透装置中，在真空度到达0.5～0.7atm后，保持30s，随后缓慢放气恢复正常气压；然后重复上述步骤一次。
[0014]优选，所述的红葱VIGS沉默体系的构建方法，还包括对照，所述的对照是用pTRV2农杆菌替换pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌，其余步骤均相同。以空白侵染液真空渗透处理的红葱植株为对照，观察侵染液真空渗透处理的红葱植株表型，检测目的基因表达情况。
[0015]本专利技术还提供红葱VIGS沉默体系的构建方法在研究红葱色素合成相关基因功能中的应用。
[0016]本专利技术还提供一类红葱色素合成相关功能基因，为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的八氢番茄红素脱氢酶基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的EbMYB5基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的EbMYB52基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的查尔酮异构酶基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的查尔酮合成酶基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的无色花色素双加氧酶基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的黄酮糖基转移酶基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的类黄酮3
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羟化酶基因。
[0017]本专利技术中，筛选侵染范围比较广泛的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)作为VIGS体系的载体。TRV是广泛应用于各种植物物种中最常见的病毒载体，它具有侵染后症状较轻、基因沉默效率高、可在多个组织产生沉默且效果长久等优点。
[0018]本专利技术以红葱八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)基因作为目的基因来创建适合红葱的VIGS沉默体系；八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)基因调控类胡萝卜素合成途径，PDS是类胡萝卜素合成途径的一个中间体，当PDS被沉默后，植物体的类胡萝卜素合成受抑制，植物呈现光漂白现象。利用基于TRV病毒的VIGS表达载体(图1)，创建红葱整体植株VIGS沉默体系。本专利技术在红葱中建立病毒诱导的VIGS实验体系，VIGS沉默体系的建立对于红葱基因功能研究具有重要意义。
附图说明
[0019]图1是烟草脆裂病毒TRV的VIGS载体图谱，包括图A的pTRV1载体和图B的pTRV2载体。
[0020]图2是EbPDS与其他物种氨基酸序列比对分析；注：AtPDS，拟南芥PDS基因；NoPDS，西洋菜PDS基因；BnPDS，油菜PDS基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种红葱VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：a.将红葱目的基因特异性片段连接至pTRV2载体的多克隆位点上，获得pTRV2
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目的基因特异性片段重组质粒，将重组质粒转化农杆菌，获得pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌，培养收集菌体备用；b.用缓冲液分别将pTRV1农杆菌、pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌的菌体重悬分散制成农杆菌菌液，然后将pTRV1农杆菌菌液与pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌菌液混合为侵染液；c.将红葱植株洗净，吸干表面水分，完全浸泡于侵染液中，进行真空渗透处理；d.用无菌水清洗植株上多余的侵染液，然后将植株于20℃下黑暗培养24h，25℃黑暗条件下平衡24h，随后正常培养，构建得到红葱的目的基因VIGS沉默体系。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的缓冲液含有10mM MES、200μM乙酰丁香酮和10mMMgCl2，余量为水，pH 5.6。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的pTRV1农杆菌菌液、pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌菌液的OD600＝1，pTRV1农杆菌菌液与pTRV2
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目的基因特异性片段农杆菌菌液按体积比1：1混合为侵染液。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的用于真空渗透处理的红葱植株为6～8个月生长期的红葱植株。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的真空渗透处理为：于真空渗透装置中，在真空度到达0.5～0.7atm后，保持30s，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丛丛，林国森，何春梅，王洪峰，苏凌业，徐明锋，
申请(专利权)人：广东省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：