基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体及构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体及构建方法和应用，所述本氏烟基因为NbbZIP60基因，如SEQ ID NO:4所示；针对本氏烟NbbZIP60基因编码区序列靠近5

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体及构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体和应用。

技术介绍

[0002]TYLCCNV是一种单组份双生病毒，在田间伴随着卫星DNAβ(TYLCCNB)。 TYLCCNV/TYLCCNB复合侵染烟草、番茄、辣椒等多种茄科作物，感染的作物产生明显的矮化、叶片卷曲、黄化等症状，严重导致作物减产，造成巨大的经济损失，危害农业生产。
[0003]我国大部分省市的番茄、烟草等种植区长期受到TYLCCNV/TYLCCNB复合侵染的危害。目前，在研究和生产中可用的抗双生病毒资源非常有限，而且病毒的快速进化与田间、温室作物上病毒病的复合侵染严重等都会导致抗双生病毒的种质资源不断丧失抗性。如番茄Ty
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1 介导的对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的抗性会被其他病毒所抑制，抗木薯花叶病害(由多种木薯花叶双生病毒引起)的木薯CMD2抗性基因在植物体细胞胚胎发生再生时会丢失。
[0004]此外，目前生产上缺乏有效的抗病毒药剂来防治双生病毒病害，因此在以预防病毒病害发生的基础上，选育抗病毒品种尤为重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体及构建方法和应用。通过设计针对TYLCCNV/TYLCCNB研究的模式植物本氏烟的感病基因NbbZIP60的 gRNA，构建了利用编辑上述内源基因实现阻碍双生病毒侵染的农杆菌侵染性克隆载体。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
[0007]一种基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体的构建方法，其特征在于：所述本氏烟基因为NbbZIP60基因，如SEQ ID NO:4所示；针对本氏烟NbbZIP60基因编码区序列靠近 5
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端的PAM位点设计特异性靶向NbbZIP60的gRNA，构建pCambia 1300
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BKG
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g1载体，简称BKG
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g1载体。
[0008]具体而言，包括以下步骤：
[0009](1)在本氏烟NbbZIP60基因编码区序列靠近5
’
端搜寻PAM位点并设计特异性靶向 NbbZIP60的gRNA；
[0010](2)根据所设计的靶点序列以及载体插入位置的酶切位点信息合成两条单链gRNA的 oligo片段，如SEQ ID NO：1
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2所示，然后经退火后形成带有粘性末端酶切位点的互补双链；
[0011](3)用限制性内切酶Eco31I线性化BKG载体，纯化回收；
[0012](4)用T4 DNA连接酶连接线性化的BKG载体与双链化的gRNA；
[0013](5)转化DH5α大肠杆菌，筛选鉴定阳性克隆，阳性克隆质粒测序，获得正确插入
gRNA 的BKG载体。
[0014]将上述构建方法获得的载体质粒转化EHA105农杆菌，获得农杆菌侵染性克隆菌株。
[0015]本专利技术基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体可以用于抵御依赖本氏烟寄主 NbbZIP60完成复制侵染的植物病毒的侵染。
[0016]本专利技术基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体可以通过在本氏烟的瞬时表达或遗传转化该载体获得稳定表达材料。
[0017]本专利技术基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体可用于抵御双生病毒的侵染。
[0018]同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：
[0019]本专利技术基于CRISPR/Cas9系统靶标并编辑本氏烟NbbZIP60基因来抑制 TYLCCNV/TYLCCNB侵染。本氏烟NbbZIP60基因是专利技术人研究团队鉴定出的与 TYLCCNV/TYLCCNB编码的致病因子βC1蛋白直接相关的基因，通过对上述基因的编辑阻碍病毒依靠其进行侵染从而达到抗病毒效果。
[0020]本专利技术构建出的抑制TYLCCNV/TYLCCNB侵染的载体BKG
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g1具有以下特征和优势：
[0021](1)对本氏烟的NbbZIP60基因序列的进行定点编辑；
[0022](2)与传统的育种方法相比能更快更有效的获得抗病材料；
[0023](3)该载体编辑的NbbZIP60基因是双生病毒TYLCCNV/TYLCCNB复制时所依赖的重要感病寄主基因，应用该载体可明显减轻TYLCCNV/TYLCCNB的侵染。
[0024](4)该载体编辑NbbZIP60基因后的本氏烟植物生长发育正常，没有明显的发育缺陷，有利于后代的繁育。
[0025](5)该载体编辑NbbZIP60基因的本氏烟植物可以作为研究双生病毒在寄主体内复制侵染的机理研究以及为抗病品种选育做参考。
[0026](6)该载体可以应用到其他依赖NbbZIP60基因的双生病毒的抗病研究中。
[0027]下面结合附图说明和具体实施例对本专利技术所述的基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体及构建方法和应用作进一步说明。
附图说明
[0028]图1为基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因NbbZIP60的载体构建示意图；
[0029]图2为针对NbbZIP60基因编辑的载体对双生病毒TYLCCNV/TYLCCNB侵染的抑制效果。
[0030](A)cas9
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NbbZIP60编辑的本氏烟植物的表型，与野生型Wt相比较长势良好，没有明显的发育缺陷。
[0031](B)编辑位点的测序结果，提取转入编辑载体的植物的DNA，扩增编辑区域上下游200bp 后测序比对，发现PAM位点附近存在NbbZIP60序列的编辑，发生了碱基的插入或缺失，从而导致其后的翻译移码最终实现NbbZIP60的敲除。
[0032](C)TYLCCNV/TYLCCNB侵染野生型本氏烟和NbbZIP60编辑的本氏烟7天之后的植物病毒症状。
[0033](D)qPCR检测TYLCCNV/TYLCCNB的病毒积累水平。对图2C中的本氏烟系统叶片提取
DNA，经qPCR分析与对照相比病毒DNA水平的差异，25S rRNA作为内参，**代表显著水平P＜0.01。
具体实施方式
[0034]实施例1
[0035]结合图1所示，基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体的构建方法，具体步骤如下：
[0036](1)利用华中农业大学开发的CRISPR工具(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)在本氏烟NbbZIP60基因编码区序列靠近5
’
端选定合适的PAM位点并设计特异性的gRNA；因为插入到载体上的序列只有20个碱基，因此通过先合成两条引物，然后再退火成具有粘性末端的杂交双链。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体的构建方法，其特征在于：所述本氏烟基因为NbbZIP60基因，如SEQ ID NO:4所示；针对本氏烟NbbZIP60基因编码区序列靠近5
’
端的PAM位点设计特异性靶向NbbZIP60的gRNA，构建pCambia 1300
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BKG
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g1载体。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计能够特异性靶向本氏烟内源基因NbbZIP60的gRNA，合成两条单链gRNA，如SEQ ID NO：1
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2所示，然后经退火后合成互补双链；(2)用限制性内切酶Eco31I线性化BKG载体，纯化回收；(3)用T4 DNA连接酶连接线性化的BKG载体与双链化的gRNA；(4)转化DH5α大...

【专利技术属性】
技术研发人员：李方方，周雪平，赵斯文，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：