测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法技术

本发明专利技术公开了测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，包括以下步骤：步骤一，叶片瞬时表达和载体构建；步骤二，农杆菌介导在本氏叶片瞬时表达农杆菌菌株；步骤三，叶片细胞微粒体的提取；步骤四，体外LPAAT反应；步骤五，LC

【技术实现步骤摘要】
测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法


[0001]本专利技术涉及酶动力学分析
，具体为测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法。

技术介绍

[0002]LPAAT基因家族及其同源基因，属于膜结合型酰基转移酶的超级家族，LPAAT是磷脂和三酰基甘油合成的关键中间体，在生成PA过程中起着重要作用，因此体外LPAAT酶活性测定能够准确了解这些酶的生理功能，在植物中LPAAT与叶绿体、内质网膜和线粒体膜紧密相连，在拟南芥质体中，溶血磷脂酸转移酶是胚胎合成的关键调控因子，多种基因在不同器官或组织中生产不同类型的脂中间产物，在功能和活力中有较大的差异，因此，体外溶血磷脂酸酰基转移酶的参数测定，底物偏好测定和活力测定非常有意义，但此类测定目前多依赖于放射性同位素技术，该方法底物高昂，对人体不利，且传统方法只能在同一个反应中检测同一种酶的反应参数。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，包括以下步骤：步骤一，叶片瞬时表达和载体构建；步骤二，农杆菌介导在本氏叶片瞬时表达农杆菌菌株；步骤三，叶片细胞微粒体的提取；步骤四，体外LPAAT反应；步骤五，LC
‑
MS脂组学测定；
[0005]其中在上述步骤一中，将含有35S启动子调控的p19基因的表达载体转入GV3101农杆菌系中，将拟南芥叶片的LPAAT序列和油菜的LPAAT序列的内含子经优化克隆进pJP3343载体，最终将载体导入农杆菌AGL1随同病毒沉默蛋白p19注射进烟草的叶片，待用；
[0006]其中在上述步骤二中，首先将含基因表达载体的农杆菌接种于LB培养基，于28℃条件下黑暗培养至生长对数期，然后离心收集菌体，加buffer重悬，于28℃继续培养2h，最后注射到本氏烟草叶片并标记注射范围，光照培养5天后沿标记区域剪下叶片，冻干待用；
[0007]其中在上述步骤三中，取步骤二中所制备的冻干叶片，于研钵中加液氮研磨成粉，加buffer A充分研磨，离心后弃上清，再使用buffer B润洗底部微粒体，并转入匀浆器充分研磨，最后通过液氮极速冷冻，于
‑
80℃保存，待用；
[0008]其中在上述步骤四中，反应总体积为100ul，以6nM的LPA作为底物，6nM乙酰辅酶A为酰基供体，50ul缓冲液(0.2M、pH＝7的Tris，0.4M的蔗糖，20ug/ul的牛血清蛋白BSA)和15μg步骤三中制备的微粒体进行体外LPAAT反应，将上述4种成分充分混合后，在室温下700rpm震荡培养30min，在反应的0，5，10，15和30min分别取出15μL反应混合物加入1.2mL的氯仿/甲醇(2/1，v/v)和0.3mL的KCl终止反应，再以2500rpm的速度震荡7min，以1700xg离心5min，收集下层脂质相，将收集的脂质溶液的溶剂在氮气下吹干，备用；
[0009]其中在上述步骤五中，取LPAAT体外干燥油样，溶解于20μL的叔丁醇和甲醇混合溶液，取2μL进行LC
‑
MS分析。
[0010]优选的，所述步骤一中，p19基因为番茄丛矮病病毒沉默抑制子，拟南芥叶片的LPAAT序列为NP_567052，油菜的LPAAT序列为NP_001302955。
[0011]优选的，所述步骤二中，LB培养基配方为10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母膏和5g/L的NaCl，pH＝7.0；buffer为5mM的MES、5mM的MgSO4和100μM的乙酰丁香酮，pH＝5.7。
[0012]优选的，所述步骤二中，离心收集菌体是取200μL培养液于10mL培养基中再次培养，然后在4000r/min下离心5min。
[0013]优选的，所述步骤三中，buffer A为pH7.2的K2HPO4/KH2PO4溶液、0.33m蔗糖、0.1％牛血清蛋白和1000U/mL过氧化氢酶；离心条件为：37000r/min，温度为4℃，离心时间为90min；buffer B为pH7.2的K2HPO4/KH2PO4溶液。
[0014]优选的，所述步骤五中，混合溶液中叔丁醇和甲醇的比例为1:1，且混合溶液中含有10mM丁羟甲苯。
[0015]优选的，所述步骤五中，色谱条件：Waters BEHC8色谱柱(100
×
2.1mm，2.7μm)；流动相：A相为乙腈
‑
甲醇
‑
水(5:4:1，v/v，含0.2％甲酸，10mmol/L甲酸胺和8mmol/L磷酸)；B相为异丙醇
‑
乙腈
‑
水(15:3:1，v/v，含0.2％甲酸，10mmol/L甲酸胺和8mmol/L磷酸)；流速：200μL/min；柱温：40℃；进样量：2μL。
[0016]优选的，所述步骤五中，质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，负离子扫描模式，干燥气体温度和流速分别为210℃和15L/min，喷雾器电压为20psi，鞘气流速和温度分别为10L/min和350℃，喷嘴电压1000V，离子气流温度和流速为350℃和10L/min，喷雾器压强20psi，喷嘴电压1000V，毛细管电压3000V，二级离子漏斗的高低压辐射频率分别为120kHz、180kHz。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用LC
‑
MS非放射性检测技术测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数，具有高效分离能力和高灵敏度检测能力，能够在单次分析中量化不同的脂质类别，该法简单快捷，且避免了放射性底物对人体的伤害，同时结合三重四极技术实现了对目标脂质化合物的高通量分析，并可以根据质谱仪的采集速度等因素对目标种类的动态范围进行量化。
附图说明
[0018]图1为本专利技术的方法流程图；
[0019]图2为基于LC
‑
MS技术检测PA和DAG的合成动力学参数特征曲线图。
具体实施方式
[0020]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0021]请参阅图1
‑
2，本专利技术提供的一种实施例：测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，包括以下步骤：步骤一，叶片瞬时表达和载体构建；步骤二，农杆菌介导在本氏叶片
瞬时表达农杆菌菌株；步骤三，叶片细胞微粒体的提取；步骤四，体外LPAAT反应；步骤五，LC
‑
MS脂组学测定；
[0022]其中在上述步骤一中，将含有35S启动子调控的p19基因的表达载体转入GV3101农杆菌系中，将拟南芥叶片的LPAAT序列和油菜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，包括以下步骤：步骤一，叶片瞬时表达和载体构建；步骤二，农杆菌介导在本氏叶片瞬时表达农杆菌菌株；步骤三，叶片细胞微粒体的提取；步骤四，体外LPAAT反应；步骤五，LC
‑
MS脂组学测定；其特征在于：其中在上述步骤一中，将含有35S启动子调控的p19基因的表达载体转入GV3101农杆菌系中，将拟南芥叶片的LPAAT序列和油菜的LPAAT序列的内含子经优化克隆进pJP3343载体，最终将载体导入农杆菌AGL1随同病毒沉默蛋白p19注射进烟草的叶片，待用；其中在上述步骤二中，首先将含基因表达载体的农杆菌接种于LB培养基，于28℃条件下黑暗培养至生长对数期，然后离心收集菌体，加buffer重悬，于28℃继续培养2h，最后注射到本氏烟草叶片并标记注射范围，光照培养5天后沿标记区域剪下叶片，冻干待用；其中在上述步骤三中，取步骤二中所制备的冻干叶片，于研钵中加液氮研磨成粉，加buffer A充分研磨，离心后弃上清，再使用buffer B润洗底部微粒体，并转入匀浆器充分研磨，最后通过液氮极速冷冻，于
‑
80℃保存，待用；其中在上述步骤四中，反应总体积为100ul，以6nM的LPA作为底物，6nM的乙酰辅酶A为酰基供体，50ul的缓冲液(0.2M、pH＝7的Tris，0.4M的蔗糖，20ug/ul的牛血清蛋白BSA)和15μg步骤三中制备的微粒体进行体外LPAAT反应，将上述4种成分充分混合后，在室温下700rpm震荡培养30min，在反应的0，5，10，15和30min分别取出15μL反应混合物加入1.2mL的氯仿/甲醇(2/1，v/v)和0.3mL的KCl终止反应，再以2500rpm的速度震荡7min，以1700xg离心5min，收集下层脂质相，将收集的脂质溶液的溶剂在氮气下吹干，备用；其中在上述步骤五中，取LPAAT体外干燥油样，溶解于20μL的叔丁醇和甲醇混合溶液，取2μL进行LC
‑
MS分析。2.根据权利要求1所述的测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，其特征在于：所述步骤一中，p19基因为番茄丛矮病病毒沉默抑制子，拟南芥叶片的LPAAT序列为NP_567052，油菜的LPAAT序列为NP_001302955。3.根据权利要求1所述的测定溶血磷脂酸酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯天宇，李会珍，张志军，胡楠，邢云，周雪荣，
申请(专利权)人：中北大学，
类型：发明
国别省市：