一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，包括以下步骤：(1)农杆菌活化培养；(2)农杆菌悬浮液的制备；(3)外植体的准备；(4)侵染；(5)共培养；(6)植株再生。本发明专利技术利用基因编辑技术，通过添加乙酰丁香酮，提高烟草外植体产生愈伤组织比率，可将烟草组织培养产生愈伤组织的时间缩短至20

【技术实现步骤摘要】
一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法


[0001]本专利技术涉及植物细胞工程
，特别涉及一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法。

技术介绍

[0002]植物和微生物可以通过一些化学物质分子，以化学的方式发生相互作用。农杆菌对酚类化合物具有趋化性，而且这种趋化性依赖于VirA和VirG基因。烟草叶子的受伤部位比非受伤叶子具有明显的诱导作用，并从受伤植物细胞中分离提取出了乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，将其作为趋化物来识别。AS作为诱导性最好的酚类化合物，其作用机理主要是通过诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进T
‑
DNA的加工与转移，从而使农杆菌T
‑
DNA更易进入植物基冈组并与其整合。农杆菌Ti或Ri质粒的Vir区编码产物负责接收外界信号、T
‑
DNA的加工、转移及整合等功能，对菌种的侵染力起决定性的作用。
[0003]AS是双子叶植物细胞壁合成的前体，一般认为细胞渗出液中含有0.5
‑
1.0μmol/L的AS即可诱导农杆菌Vir区基因活化，但最适诱导浓度要更高。因此，大多双子叶植物的遗传转化仍需补充AS以提高转化率，也有少数双子叶植物在受伤的组织中可以产生一些酚类物质，这些酚类物质已能起到活化基因的作用，所以在遗传转化中加入AS转化效率并没有明显提高。
[0004]农杆菌介导的植物转基因的效率和T
‑
DNA进入植物细胞是多个物理
‑
化学因素和生理条件共同作用的结果，多种因素影响转化效率。乙酰丁香酮(AS)是酚类化合物的一种，能有效促进农杆菌将外源基因转入植物体内。目前，AS在烟草基因编辑遗传转化及组织培养中的使用未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，其克服了现有技术的上述缺陷，解决了基因编辑技术在烟草中使用时遗传转化率和组织培养效率较低的问题。
[0006]本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0007]一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，包括以下步骤：
[0008](1)农杆菌活化培养：取出
‑
80℃保存的电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融；待感受态解冻时，加入编辑载体质粒，混匀，置于冰上；将混匀的感受态转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1mL的YEB液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5
‑
2h；8,000rpm离心菌体弃掉上清培养基，然后用200μL的YEB液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/L利福平、50mg/L链霉素和75mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上28℃倒置黑暗培养2
‑
3d；
[0009](2)农杆菌悬浮液的制备：将步骤(1)的菌体加入含0.2mmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中，调节菌液的OD600为0.6
‑
0.8，混匀，得农杆菌侵染菌液；
[0010](3)外植体的准备：取饱满的烟草种子，在超净工作台中，用75％酒精清洗种子30s，水清洗2次，再用1％AgNO3溶液消毒10min，水清洗4
‑
5次，再将种子在灭菌滤纸上吸干水分后进行接种；将种子接种到MS培养基中，温度25
±
1℃，光照强度30
‑
50μmol/(m2·
s)，光照时间为16h/d，培养60d，得幼苗；
[0011](4)侵染：将步骤(3)得到的幼苗，利用手术刀将其叶片切成1cm2左右的叶盘，将叶盘置于步骤(2)制备好的农杆菌悬浮液中浸泡10min；
[0012](5)共培养：浸泡结束后，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至在共培养基上进行暗培养，共培养培养基为MS共培养基1号或MS共培养基2号上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d；
[0013](6)植株再生：
[0014]将步骤(5)共培养3d的叶盘从培养箱中取出，转置于MS继代培养基上，28℃光照培养16h/d，光照强度30
‑
50μmol/(m2·
s)，25℃黑暗培养8h/d，每7
‑
10d更换一次培养基，逐渐形成分化芽；
[0015]将上述已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于MS生根培养基上进行培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30
‑
50μmol/(m2·
s)，25℃黑暗培养8h/d，培养7
‑
10d，待愈伤组织上分化芽培养长至2
‑
4cm高；
[0016]将上述分化芽切下，插入含有250mg/L羧苄青霉素和75mg/L卡那霉素的MS培养基上进行生根培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30
‑
50μmol/(m2·
s)，25℃黑暗培养8h/d，7
‑
10d即可生根。
[0017]优选地，步骤(1)中的编辑载体质粒的构建方法如下：
[0018]设计CRISPR/Cas9系统敲除目的基因的sgRNA序列、上游引物以及下游引物，双链退火并与预先用BsaI酶切过的骨架载体连接，连接产物转化大肠杆菌培养后进行阳性克隆的PCR扩增、克隆和测序筛选，从测序正确的菌中提取纯化质粒，
‑
20℃冰箱保存备用。
[0019]优选地，目的基因为烟草PDS基因，其中：
[0020]PDS
‑
sgRNA序列为：GCTGCATGGAAAGATGATGATGG；
[0021]sgRNA PCR引物为：
[0022]PDS
‑
sgRNA上游引物：GATTGGCT GCATGGAAAGATGATGA；
[0023]PDS
‑
sgRNA下游引物：AAACTCATCATCTTTCCATGCAGCC。
[0024]优选地，步骤(1)中的连接体系为：酶切载体100ng，退火产物2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL，16℃连接30min。
[0025]优选地，步骤(1)的YEB培养固体基为牛肉膏粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，琼脂15g/L，121℃灭菌15min，灭菌后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后备用。
[0026]优选地，步骤(2)的MS液体培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却后备用。
[0027]优选地，步骤(3)的MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，灭菌后在500mL培养瓶中倒入100mL培养基，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)农杆菌活化培养：取出
‑
80℃保存的电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融；待感受态解冻时，加入编辑载体质粒，混匀，置于冰上；将混匀的感受态转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1mL的YEB液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5
‑
2h；8,000rpm离心菌体弃掉上清培养基，然后用200μL的YEB液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/L利福平、50mg/L链霉素和75mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上28℃倒置黑暗培养2
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3d；(2)农杆菌悬浮液的制备：将步骤(1)的菌体加入含0.2mmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中，调节菌液的OD600为0.6
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0.8，混匀，得农杆菌侵染菌液；(3)外植体的准备：取饱满的烟草种子，在超净工作台中，用75％酒精清洗种子30s，水清洗2次，再用1％AgNO3溶液消毒10min，水清洗4
‑
5次，再将种子在灭菌滤纸上吸干水分后进行接种；将种子接种到MS培养基中，温度25
±
1℃，光照强度30
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50μmol/(m2·
s)，光照时间为16h/d，培养60d，得幼苗；(4)侵染：将步骤(3)得到的幼苗，利用手术刀将其叶片切成1cm2的叶盘，将叶盘置于步骤(2)制备好的农杆菌悬浮液中浸泡10min；(5)共培养：浸泡结束后，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至在共培养基上进行暗培养，共培养培养基为MS共培养基1号或MS共培养基2号上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d；(6)植株再生：将步骤(5)共培养3d的叶盘从培养箱中取出，转置于MS继代培养基上，28℃光照培养16h/d，光照强度30
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50μmol/(m2·
s)，25℃黑暗培养8h/d，每7
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10d更换一次培养基，逐渐形成分化芽；将上述已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于MS生根培养基上进行培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30
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50μmol/(m2·
s)，25℃黑暗培养8h/d，培养7
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10d，待愈伤组织上分化芽培养长至2
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4cm高；将上述分化芽切下，插入含有250mg/L羧苄青霉素和75mg/L卡那霉素的MS培养基上进行生根培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30
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50μmol/(m2·
s)，25℃黑暗培养8h/d，7
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10d即可生根。2.根据权利要求1所述的提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，其特征在于，步骤(1)中的编辑载体质粒的构建方法如下：设计CRISPR/Cas9系统敲除目的基因的sgRNA序列、上游引物以及下游引物，双链退火并与预先用BsaI酶切过的骨架载体连接，连接产物转化大肠杆菌培养后进行阳性克隆的PCR扩增、克隆和测序筛选，从测序正确的菌中提取纯化质粒，
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20℃冰箱保存备用。3.根据权利要求2所述的提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋佳芮，向海英，许力，曾婉俐，张建铎，高茜，米其利，杨文武，邓乐乐，李雪梅，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：