本发明专利技术涉及一种用于治疗糖尿病和/或肥胖症的融合蛋白，该融合蛋白的结构为：GLP
【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗糖尿病和/或肥胖症的融合蛋白
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一系列新型的半衰期延长且活性提高的GLP-1受体激动剂，其主要应用于糖尿病治疗领域或肥胖治疗领域。
技术介绍
[0002]随着人们生活水平的提高、饮食结构的变化以及体力劳动的减少等，糖尿病患者的数量呈现逐渐增长的态势。
[0003]糖尿病是一种以高血糖为主要特征的慢性代谢疾病，目前已成为严重威胁人类健康的疾病之一，且发病率呈逐年上升的趋势。2017年全世界糖尿病患者为4.2亿，预计到2045年这一数字将达到6.3亿。我国糖尿病人口总数已经超过了1.14亿，2型糖尿病患者超过90％以上，而其中肥胖人群占约80％以上。2型糖尿病的主要病因是胰岛素抵抗(Insulin resistance)，并伴有不同程度的胰岛素分泌不足。
[0004]胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide 1，GLP-1)是由小肠L-细胞在饮食后分泌，具有葡萄糖依赖的肠促胰岛素效应(Glucose dependent incretin effect)的多肽类激素。GLP-1在体内有两种结构GLP-1(7-37)和N端酰胺化的GLP-1(7-36)，分别含有31个和30个氨基酸。这两种结构都能与细胞表面受体(GLP-1R，一种G蛋白偶联受体)结合，发挥促进胰岛素分泌、促进胰岛β细胞的增殖及分化、抑制胰高血糖素分泌、产生饱腹感、抑制进食、抑制胃排空等作用，从而能够显著降低血糖水平，并能有效减轻体重。因此，GLP-1可以被用来治疗糖尿病和肥胖。
[0005]艾塞那肽(Exenatide，Ex)是GLP-1的类似物，含有39个氨基酸，是从毒蜥蜴的唾液中分离出来的多肽类激素；与哺乳动物GLP-1具有53％的同源性，其在体内也能与GLP-1受体结合，发挥与GLP-1类似的作用；GLP-1与Ex也被称为GLP-1受体激动剂。GLP-1和Ex被认为是治疗2型糖尿病和肥胖的理想药物。因此，鉴于GLP-1受体激动剂具有治疗2型糖尿病和肥胖的双重功能，2010年，美国FDA先批准了诺和诺德的GLP-1类似物利拉鲁肽(商标名Victoza)用来治疗2型糖尿病；然后，在2014年，又批准了利拉鲁肽(商标名Saxenda)用于治疗肥胖或超重。
[0006]然而，GLP-1由于在体内受到二肽基肽酶-4(Dipeptidyl Peptidase 4，DPP-4)对其N端的降解，以及肾脏的快速过滤排出作用，其半衰期仅有1-2分钟，严重影响其作为药物的应用潜力。而艾塞那肽的分子量也较小，容易受到肾脏的过滤排出作用，在人体内的半衰期仅有2.4h，需要每日注射两次，较高的注射频率严重降低了患者的依从性。因此，解决GLP-1和艾塞那肽半衰期较短这一关键技术瓶颈将推动GLP-1和艾塞那肽在临床上的应用，具有重要意义。
[0007]目前用于延长GLP-1或艾塞那肽的半衰期的方法有：
[0008]1)氨基酸替换。天然的GLP-1的前两个氨基酸是组氨酸和丙氨酸，容易被体内的DPP-4所识别而切割，从而失去活性。因此，丙氨酸可以被替换成丝氨酸、甘氨酸或其他的非天然氨基酸，这样DPP-4不能识别该位点，从而延长半衰期；且突变后其活性不受损失。如艾
塞那肽在这个位置的氨基酸为甘氨酸，半衰期显著延长。
[0009]2)PEG修饰。聚乙二醇(PEG)是美国FDA批准的可体内注射的药用成分之一。将PEG与GLP-1序列上的组氨酸和赖氨酸反应，可以将不同分子量的PEG与GLP-1连接，从而增加GLP-1的分子大小，减缓肾脏的过滤排出作用，也能降低蛋白酶的降解，从而延长半衰期。
[0010]3)构建融合蛋白。融合蛋白是将2个或2个以上的基因序列连接，并由一个宿主细胞进行表达后的产物。如2个GLP-1分子串联后，在与人血清白蛋白(HSA)进行结合，研发出了阿必鲁肽，是葛兰素史克(GSK)与2014年EMA批准上市的一个长效GLP-1受体激动剂。该药物是在GLP-1氨基酸序列改造(甘氨酸取代丙氨酸)的基础上，在GLP-1的C-末端融合了人血清白蛋白(585个氨基酸)，这样不仅可以避免了DPP-4的降解，还增加了GLP-1的分子量，增加了其流体力学体积，从而减少了肾脏对GLP-1的过滤排出作用，从而显著延长了半衰期，在人体内的半衰期达到了6-8天。
[0011]美国礼来公司研发了一种GLP-1与IgG Fc的融合蛋白(杜拉鲁肽)，杜拉鲁肽对GLP-1的序列进行了一些改造，将第8位丙氨酸突变为甘氨酸，将26位的甘氨酸替换为谷氨酸，将第36位的精氨酸替换为甘氨酸，然后通过一个连接肽与Fc片段连接，在人体内的半衰期达到了4天。
[0012]4)FcRn(新生儿Fc受体)介导的循环再生再生作用来延长半衰期。阿必鲁肽和杜拉鲁肽具有显著延长的半衰期，除了依靠人血清白蛋白和Fc显著增加了GLP-1的分子大小外，还能与FcRn进行结合，依靠FcRn介导的循环再生作用，而延长半衰期。FcRn是一种膜蛋白受体，主要存在于上皮细胞和内皮细胞，但在肝脏、肾脏和肠细胞也有分布。在血液中，人血清白蛋白和IgG能与FcRn以一种pH依赖的方式结合；与FcRn结合后，经胞吞作用被细胞吸收后，在内涵体的酸性环境(pH<6.5)中与FcRn结合，可以免受溶酶体的降解；在生理pH(7.4)时，HSA和IgG重新释放到血液中，从而明显延长了人血清白蛋白和IgG的半衰期，使其在体内的半衰期可达19天和21天。利用FcRn介导的循环再生机制延长其在血液中的半衰期。
[0013]虽然以上技术能够延长GLP-1或者艾塞那肽的半衰期，但是在实际生产和应用过程中也存在一些问题。如PEG方法，生产成本较高，会导致药物活性降低；近年来又发现PEG修饰的蛋白和其降解物容易在肾脏中累积，干扰了正常肾脏的过滤作用；且人会对PEG产生一定的抗体，表明其具有一定的免疫原性。
[0014]Fc的细胞毒作用和补体激活作用有时会对机体造成一定的伤害；Fc融合蛋白多为二聚体形式，过大的分子质量会影响药物分子通过粘膜的速率；Albumin融合蛋白在其发酵、纯化和储存过程中易发生降解和聚合现象，会导致活性损失，并有可能引起毒副作用；Albumin和Fc需要通过酵母或者哺乳动物细胞进行表达，周期较长，成本较高。
[0015]因此，有必要开发一种免疫原性低、成本较低、表达纯化更简单的载体，来延长GLP-1或艾塞那肽(Ex)的半衰期，进一步降低生产成本，减轻患者的经济负担，提高患者的依从性。
技术实现思路
[0016]本专利技术主要是将糖尿病治疗多肽GLP-1或艾塞那肽(Ex)以基因融合的方式通过连接肽与白蛋白结合蛋白(各种ABD结构域或DARPin蛋白)连接，并在表达系统中进行表达，从而获得GLP-1、Ex与ABD或DARPin的融合蛋白，获得的融合蛋白具有延长的半衰期和延长的
降血糖活性，可以应用于治疗2型糖尿病或减轻体重。
[0017]本专利技术采用的技术方案为：
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白的结构为：GLP-1或其类似物、衍生物—连接肽—白蛋白结合蛋白。2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于：所述白蛋白结合蛋白包括ABD结构域(GA3、ABD035、ABDCon)或可以靶向HSA的DARPin。3.根据权利要求2所述的一种融合蛋白，其特征在于：所述的白蛋白结合蛋白的序列包括如下序列的一种：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.30。4.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于：所述GLP-1或其类似物、衍生物为具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.24所述的序列或与该序列具有至少60％相同性的序列；更优选地，至少具有80％的相同性；更优选地，至少具有95％的相同性。5....
【专利技术属性】
技术研发人员：谭焕波，邹培建，苏文成，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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