一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法技术方案

本发明专利技术提供了一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法。包括表达编码重组疫苗的重组DNA，该重组疫苗包括重组疫苗蛋白和定位到植物膜上的锚定多肽形成的融合蛋白。本发明专利技术解决了现有技术中，免疫原性低的问题。通过采用了重组疫苗蛋白和锚定多肽形成的融合蛋白，使得重组疫苗的免疫原性明显升高。重组疫苗的免疫原性明显升高。重组疫苗的免疫原性明显升高。

【技术实现步骤摘要】
一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法


[0001]本专利技术涉及重组DNA
，尤其涉及一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法。

技术介绍

[0002]目前，临床使用的重组蛋白类药物大多数来自于哺乳动物细胞和大肠杆菌表达生产平台，少部分来自酵母和昆虫细胞。与哺乳动物细胞类似，植物细胞同样拥有内膜系统，因此可以利用分子伴侣折叠和组装重组蛋白。而与动物表达系统相比，植物表达系统缺少动物病原性的污染物、培养基价格低廉(Schillberg等,Journal of plant physiology 258(2021):153359.)。
[0003]作为生物反应器来生产外源蛋白的植物生产平台，可以是转基因植株，也可以是悬浮培养细胞，可以是稳定表达，也可以是瞬时表达。稳定表达系统是利用稳定转化的方式将外源基因及其相关转录和翻译调控元件整合到植物核基因组或质体基因组进行重组蛋白质的表达和生产；瞬时表达是指引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合，但是可以在载体进入细胞后约12小时表达，并且可以在2到8天内检测到基因产物。
[0004]当前，人以及牲畜所用的疫苗来源主要是灭活疫苗、减毒疫苗和通过基因工程技术得到的亚单位疫苗、类病毒颗粒，以及编码疫苗表面抗原的核酸类疫苗。作为真核生物，植物作为生产亚单位疫苗、类病毒颗粒的宿主已被广泛报到(LeBlanc等，2021，Viruses 13(1):5)。高等植物叶绿体作为表达体系是一种新的重组蛋白表达系统，目前已有相关研究报道。比如Svab等利用基因枪法在烟草叶绿体中成功转化rrn16基因，并获得rrn16蛋白的表达。Rubio
‑
Infante等以HIV病毒膜蛋白gp120上的V3环和C4结构域序列作为外源基因，在烟草叶绿体中成功表达C4V3抗原蛋白。但大多数叶绿体遗传转化相关研究仅限于实验室研究阶段，很少用于大规模种子和重组蛋白的规模化生产。这可能是由于在田间光照强度、复杂的环境条件下叶绿体工程植物与实验室中的表现会有所差异。另外，现有技术中，均使将病毒表面蛋白或类病毒颗粒表达在植物细胞或细胞器内部，其免疫原性有待进一步提高。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中所存在的不足，本专利技术提供了一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法，其解决了现有技术中存在重组疫苗免疫原性有待进一步提高的问题。
[0006]本专利技术一方面，提供一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法，包括表达编码重组疫苗的重组DNA，该重组疫苗包括重组疫苗蛋白和定位到植物膜上的锚定多肽形成的融合蛋白。
[0007]其中，所述植物膜包括质膜、叶绿体外膜、线粒体外膜、液泡膜、内质网、高尔基体中的一种或几种。
[0008]质膜、叶绿体外膜、线粒体外膜、液泡膜、内质网、高尔基体均是植物细胞的膜结构，将重组疫苗蛋白表达在这些植物膜系统，经动物口服后可刺激肠道黏膜免疫而产生免
疫反应，进而预防相关疾病的发生。
[0009]其中，所述锚定多肽来自膜蛋白的跨膜区。
[0010]优选地，所述锚定多肽包括：定位至质膜的CPK34蛋白N端多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1；定位至叶绿体外膜的OEP14跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，定位至叶绿体外膜的TOC34跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；定位至线粒体外膜的Tom70p蛋白N末端序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；定位至液泡膜的SYP22蛋白C端跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；定位至内质网膜的AtP24跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；定位至高尔基体膜的GALT跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0011]Toc34是位于叶绿体表面的GTP酶，可以与前体蛋白识别并通过二硫键与Toc75相互作用。OEP14位于叶绿体外膜，与Toc75共同参与将叶绿体外蛋白输入叶绿体内部。CPK34蛋白是位于质膜的钙依赖蛋白激酶34，是钙信号的感受器和效应因子。Tom70p蛋白是重要的TOM复合物成员之一，是线粒体外膜中蛋白质易位机制的主要表面受体。SYP22蛋白参与同型液泡的融合，对液泡发生起重要作用。GalT为半乳糖苷转移酶，定位于高尔基体反面。
[0012]其中，所述重组疫苗包括重组亚单位疫苗、类病毒颗粒疫苗中的一种。
[0013]重组疫苗既包括人用重组疫苗，也包括兽用重组疫苗。本专利技术方法制备的重组疫苗包括但不限于猪轮状病毒疫苗、犊牛肺肠炎病毒疫苗、流感病毒疫苗、呼吸道融合细胞病毒疫苗、诺瓦克病毒疫苗、埃博拉病毒疫苗、HIV病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、手足口病毒疫苗、新型冠状病毒疫苗，列举的这些疫苗的制备均适用于本专利技术，但并不局限于此，还包括其他重组疫苗。
[0014]优选地，所述重组疫苗为猪细小病毒疫苗。
[0015]其中，所述融合蛋白的编码基因由强启动子驱动，所述强启动子包括CaMV 35S启动子、增强型CaMV 35S启动子、NOS启动子。
[0016]其中，所述表达包括稳定表达、瞬时表达中的一种。
[0017]其中，所述植物包括烟草、生菜、浮萍、苜蓿、烟草悬浮细胞、拟南芥悬浮细胞、胡萝卜悬浮细胞。
[0018]具体地，在本专利技术的一个实施例中，利用植物膜系统生产重组疫苗的方法包括以下步骤：
[0019]1)构建重组疫苗表达载体，所述重组疫苗包括重组疫苗蛋白和定位到植物膜上的锚定多肽形成的融合蛋白；
[0020]2)转化植物；优选地，采用叶盘法进行转化。
[0021]本专利技术另一方面，提供一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法生产的重组疫苗。
[0022]相比于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0023]1、通过重组疫苗蛋白和定位到植物膜上的锚定多肽形成融合蛋白，使得重组疫苗具有更高的免疫原性，产生更多的免疫蛋白抗体。
[0024]2、本专利技术利用植物膜系统生产重组疫苗蛋白，口服后可直接到达肠内粘膜诱导部位，刺激肠道免疫组织，激活粘膜和全身免疫反应。传统免疫途径必须经过非口服途径接种才能诱导机体产生循环性抗体IgG，几乎不能产生特异的粘膜免疫，在病原体和宿主之间相互作用的起始部位直接用抗原诱发免疫反应可大大提高其有效性。IgG不能阻挡毒素从黏
膜吸收进入机体，而口服免疫可以产生分泌型IgA，能阻挡毒素从黏膜吸收进入机体。
[0025]3、与现有技术中将外源基因插入叶绿体基因组相比，本专利技术将外源基因插入到核基因组，经过传代后可以保持很好的遗传学稳定性能，适合大规模生产。
[0026]4、与现有技术中将疫苗表达于叶绿体腔体中或叶绿体内膜相比，本专利技术的疫苗蛋白表达于叶绿体外膜具有更好的免疫原性。
[0027]5、本专利技术比传统疫苗更易于储存和分发，不需要冷藏和低温运输，给药范围更广。
[0028]6、本专利技术比传统免疫途径更安全。在大规模细胞培养或繁殖过程中，不会发生病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法，其特征在于，包括表达编码重组疫苗的重组DNA，该重组疫苗包括重组疫苗蛋白和定位到植物膜上的锚定多肽形成的融合蛋白。2.如权利要求1所述的一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法，其特征在于，所述植物膜包括质膜、叶绿体外膜、线粒体外膜、液泡膜、内质网、高尔基体中的一种或几种。3.如权利要求1所述的一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法，其特征在于，所述锚定多肽来自膜蛋白的跨膜区。4.如权利要求1所述的一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法，其特征在于，所述锚定多肽包括：定位至质膜的CPK34蛋白N端多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1；定位至叶绿体外膜的OEP14跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，定位至叶绿体外膜的TOC34跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；定位至线粒体外膜的Tom70p蛋白N末端序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；定位至液泡膜的SYP22蛋白C端跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；定位至内质网膜的AtP24跨膜区，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪国鹏，相深，杨纬经，
申请(专利权)人：猎境嘉兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：