一种含有靶向Her-2CAR序列的核酸构建体及其应用制造技术

一种含有靶向Her

【技术实现步骤摘要】
一种含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体及其应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤免疫疗法领域，特别涉及一种含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体及其应用。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)免疫细胞疗法是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。其通过外源基因转染技术，把识别肿瘤相关抗原的单链抗体(Single chain fragment variable，scFv)和免疫细胞活化序列的融合蛋白即嵌合抗原受体(CAR)表达到免疫细胞表面，使可以特异识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与免疫细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达CAR的免疫细胞(如T细胞、NK细胞)以抗原依赖、但非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。
[0003]CAR与肿瘤细胞上肿瘤相关抗原结合后为免疫提供活化信号引起免疫细胞活化，表现为CARs依赖的杀伤、增殖及细胞因子释放，从而发挥杀伤肿瘤细胞的作用。这些效应功能可用来设计合成新的CAR如包含多个嵌合活化区的CAR，如胞内具有1个、2个或3个信号基序的1代、2代和3代CARs。早期设计的CARs比较简单，仅有一个胞内信号区，又称第1代CAR，信号主要通过CD3ζ上的免疫受体酪氨酸激酶活化基序(immunoreceptor tyrosine
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based activation motif,ITAM)传导，与CD3分子相比，只有3个ITAM，且缺乏共刺激分子传导的第2信号，因此第1代CARs只有较弱的抗肿瘤作用，由于缺乏T细胞增殖的第2信号，T细胞在结合肿瘤抗原后很难进一步增殖,因此在临床应用中效果较差；2代CARs是在1代的基础上添加一个胞内信号区,而这个信号区提供共刺激信号(如CD28、CD137)；3代CARs则在胞内添加了两个串联的共刺激信号区。此外，近年又出现了第4代CARs(又称TRUCKs)，即应用编码CAR和/或CAR反应性启动子的载体构建CAR，在转基因产生的细胞因子作用下CAR产生有效的信号，而这些细胞因子还可招募免疫系统的其他成分使抗肿瘤免疫效应放大。
[0004]与CAR
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T细胞不同，CAR
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NK细胞保留了通过其天然受体识别和靶向肿瘤细胞的内在能力，从而通过CAR靶向治疗时，肿瘤细胞能够逃脱杀伤的可能性降低。其次，CAR
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NK细胞疗法，在多个临床试验中，均显示数天至数周内不会发生免疫排斥反应。因此，与许多CAR
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T细胞疗法的临床试验相比，CAR
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NK细胞疗法均未表现出类似的安全问题，例如不存在细胞因子释放综合征的困扰。最后，NK细胞不需要严格的HLA匹配，因此不会引起移植物抗宿主病，这是CAR
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NK细胞疗法的巨大优势，同时也是CAR
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T细胞免疫治疗的重大风险。
[0005]HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)属于表皮生长因子受体家族，是具有酪氨酸激酶活性的一种跨膜蛋白。研究表明，在约三成的乳腺癌患者中存在着HER2基因过表达的现象。这类患者中，肿瘤的恶性程度高、具有一定的抗药性，且复发和转移的速度快，病人的无病生存期与总生存期和HER2基因的表达情况成反比。在乳腺癌的病理发生过程中，HER2的表达水平变化起到至关重要的影响，因此HER2成为了科学家们研制乳腺癌治疗药物的重要靶点。
transmembrane domain、CD28 transmembrane domain、以及NKG2D transmembrane domain，其核酸及多肽序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
[0012]优选地，所述细胞内信号传导结构域包含或不包含共刺激结构域(Costimulatory Domain，CD)，所述共刺激结构域。共刺激域通常来自CD28受体家族(CD28，ICOS)或肿瘤坏死因子受体家族(4
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1BB、OX40、CD27)。共刺激域可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，使T细胞持续增殖并释放细胞因子，提高T细胞的抗肿瘤能力。如CD28共刺激域使CAR
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T细胞依靠糖酵解代谢，促使CAR
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T细胞向效应T细胞分化。而4
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1BB共刺激域促进线粒体生成，增强呼吸作用和脂肪酸氧化，抗原刺激后，CAR
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T细胞优先分化为中央记忆T细胞。共刺激域可来源于下列蛋白质胞内功能性信号传导结域的核酸、多肽序列中的一个或多个不同组合：OX40，CD27，CD28，CDS，ICAM
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1，LFA
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1(CD11a/CD18)，ICOS(CD278)，DAP10，DAP12，4
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1BB(CD137)和2B4或其功能性变体。根据本专利技术的多个优选实施例提供的含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体的CD137 Costimulatory Domain、CD28 Costimulatory Domain、DAP10 Costimulatory Domain、以及2B4 Costimulatory Domain，其核酸及多肽序列分别如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示，SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示。
[0013]优选地，所述信号转导结构域(Signaling Domain，SD)通常为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine
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based activation motifs，ITAMs)。发挥细胞信号转导功能。根据本专利技术的优选实施例提供的含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体的CD3ζSignaling Domain，其核酸及多肽序列分别如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。
[0014]本专利技术的另一目的在提供多个优选的含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体的序列组合，各组合分别如下，其具体核酸及多肽序列如前述：
[0015]a)CD8 SP
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Her
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2 scFv(FRP5)
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CD8 H
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CD8 TMD
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CD137 CD
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CD3ζSD；
[0016]b)CD8 SP...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体是由肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域串联组成，所述肿瘤相关抗原结合区为靶向Her
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2的单链抗体FRP5 scFv，其核酸和多肽序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。2.如权利权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体还包含信号肽，所述信号肽可选自Human IgKVIII、Mouse Ig Kappa、Human IL
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2、Human insulin、CD8a的信号肽。3.如权利权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述CD8a信号肽的核酸及多肽序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。4.如权利权利要求1
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3任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述胞外铰链区的可选自CD8、CD28、CTLA4、PD
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1、NKG2D、IgG1、含或不含CH2
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CH3区域的IgG4的铰链区序列。5.如权利权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述CD8胞外铰链区、CD28胞外铰链区以及IgG4 Hinge
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CH2
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CH3胞外铰链区的核酸及多肽序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。6.如权利权利要求1
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3任一项所述所述的核酸构建体，其特征在于，所述跨膜结构域可来源于下列蛋白质跨膜结构域的核酸、多肽序列：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，DAP10，DAP12，NKG2A，NKG2D，PD
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1，CTLA。7.如权利权利要求6所述的核酸构建体，其特征在于，所述CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、以及NKG2D跨膜结构域的核酸及多肽序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。8.如权利权利要求1
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3任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述细胞内信号传导结构域包含或不包含共刺激结构域，所述共刺激结构域可来源于下列蛋白质胞内功能性信号传导结域的核酸、多肽序列中的一个或多个不同组合：OX40，CD27，CD28，CDS，ICAM
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1，LFA
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1(CD11a/CD18)，ICOS(CD278)，DAP10，DAP12，4
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1BB(CD137)和2B4或其功能性变体。9.如权利权利要求8所述的核酸构建体，其特征在于，CD137共刺激结构域、CD28共刺激结构域、DAP10共刺激结构域、以及2B4共刺激结构域的核酸及多肽序列分别如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示，SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示。10.如权利权利要求1
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3任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述信号转导结构域通常为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序。11.如权利权利要求10所述的核酸构建体，其特征在于，所述信号转导结构域为CD3ζSignaling Domain，其核酸及多肽序列分别如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。12.一种含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体是由信号肽、肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域以及包含共刺激结构域的细胞内信号传导结构域串联组成，核酸构建体中的各部件的核酸及多肽序列如权利要求1
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11所述，所述含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体可选自a)
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g)的任一组或其组合，各组合分别如...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，刘昊，胡立强，谢尚志，
申请(专利权)人：杭州乾合细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：