靶向Her-2CAR-NK应用于肿瘤治疗的方法技术

本发明专利技术公开一靶向Her

【技术实现步骤摘要】
靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法


[0001]本专利技术涉及肿瘤免疫疗法领域，特别涉及一种靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法。

技术介绍

[0002]在肿瘤的免疫疗法当中采用嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)免疫细胞疗法可说是目前最有发展前景的选项之一。其通过外源基因转染技术，把识别肿瘤相关抗原的单链抗体(Single chain fragment variable，scFv)和免疫细胞活化序列的融合蛋白即嵌合抗原受体(CAR)表达到免疫细胞表面，使可以特异识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与免疫细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达CAR的免疫细胞，现有技术中通常用的是T细胞，其以抗原依赖、但非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。在CAR与肿瘤细胞上肿瘤相关抗原结合后为免疫提供活化信号引起免疫细胞活化，表现为CARs依赖的杀伤、增殖及细胞因子释放，从而发挥杀伤肿瘤细胞的作用。这些效应功能可用来设计合成新的CAR如包含多个嵌合活化区的CAR，如胞内具有1个、2个或3个信号基序的1代、2代和3代CARs。早期设计的CARs比较简单，仅有一个胞内信号区，又称第1代CAR，信号主要通过CD3ζ上的免疫受体酪氨酸激酶活化基序(immunoreceptor tyrosine
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based activation motif,ITAM)传导，与CD3分子相比，只有3个ITAM，且缺乏共刺激分子传导的第2信号，因此第1代CARs只有较弱的抗肿瘤作用，由于缺乏T细胞增殖的第2信号，T细胞在结合肿瘤抗原后很难进一步增殖，因此在临床应用中效果较差；2代CARs是在1代的基础上添加一个胞内信号区,而这个信号区提供共刺激信号(如CD28、CD137)；3代CARs则在胞内添加了两个串联的共刺激信号区。此外，近年又出现了第4代CARs，引入一个细胞内结构域，该结构域能够触发原本由细胞因子诱导的信号(Signal 3)进一步增强T细胞应答。第四代CARs也称为TRUCK，即T cells redirected for universal cytokinemediated killing，既具有共刺激因子又具有促炎因子，例如白介素IL
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12，从而提高T细胞功效。第四代CAR不仅限于IL
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12，已开发出不同类型的分子用于构建TRUCK。这些细胞因子包括IL
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15(类似于IL
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12，这种白介素可增强T记忆干细胞的发育)、IL
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18，以及组成性活跃的细胞因子受体，例如IL
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7受体(C7R)，其目的是克服细胞因子毒性的风险。TRUCKs的其他一些测试包括敲除基因(PD
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1或DGK)和敲入基因(TRAC或CXCR4)，其目的是改善CAR表达和抗肿瘤活性。
[0003]然而现有的嵌合抗原受体免疫细胞疗法在用于肿瘤治疗上仍有许多不尽理想之处。例如CAR
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T细胞治疗过程中会出现多种不良反应，包括细胞因子释放综合征、神经系统毒性、肿瘤溶解综合征、血细胞减少、感染，低免疫球蛋白血症及乙肝病毒激活等。而且由于这些毒副反应的临床表现往往错综复杂，变化多端，进展迅速；而且每种CAR
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T细胞制品因为生产工艺或CAR结构的不同有着独特不同的毒性反应特征，因此这些毒副作用有待进一步充分的认识及精确的评估。

技术实现思路

[0004]本专利技术的一个优势在于提供一靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法，其应用一含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体转染患者NK细胞，其中所述核酸构建体的胞外抗原结合区是来源于靶向特定目标抗原的单克隆抗体，再将转染后的CAR
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NK细胞输回患者体内进行肿瘤免疫疗法，从而协助患者清除或减少体内肿瘤细胞。
[0005]本专利技术的一个优势在于提供一靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法，其中CAR
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NK细胞保留了通过其天然受体识别和靶向肿瘤细胞的内在能力，从而通过CAR靶向治疗时，肿瘤细胞能够逃脱杀伤的可能性降低，并且CAR
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NK细胞疗法，在临床试验中，均显示数天至数周内不会发生免疫排斥反应，相较于CAR
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T细胞疗法，CAR
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NK细胞疗法较安全，例如不存在细胞因子释放综合征的困扰，同时NK细胞不需要严格的HLA匹配，因此不会引起移植物抗宿主病。本专利技术的另一优势在于提供一靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法，其靶向Her
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2 CAR序列的跨膜结构域可来源于CD8、CD28和NKG2D，从而能够促进CAR在细胞表面表达。
[0006]本专利技术的另一优势在于提供一靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法，其靶向Her
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2 CAR序列的共刺激域来源于CD28、CD137、2B4和DAP10，以实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，提高NK细胞的抗肿瘤能力。
[0007]本专利技术的一个优势在于提供一靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法，其靶向Her
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2 CAR序列的信号转导结构域为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine
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based activation motifs，ITAMs)，以发挥细胞信号转导功能。
[0008]本专利技术的另一优势在于提供一靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法，其可经由慢病毒(Lentivirus)载体转染，从而具备高于γRV的转导效率、转基因负荷量更大，且基因毒性更小。
[0009]本专利技术的另一优势在于提供一靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法，其可经由慢病毒载体转染，从而区别一般的逆转录病毒载体，其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并且能将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，此外在感染能力方面也能有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。
[0010]本专利技术的另一优势在于提供一靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法，其可经由慢病毒载体转染，从而搭配本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法，其特征在于包括步骤：向受试者施用含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体的NK细胞，其中所述核酸构建体表现核酸序列选自SEQ ID NO:1
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7中的至少一种或其组合。2.根据权利要求1所述的靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方法，其具体包含如下步骤：S1.准备含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体；S2.准备NK细胞；S3.将含有靶向Her
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2 CAR序列的核酸构建体导入所述NK细胞，制成靶向Her
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2 CAR
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NK细胞；以及S4.将所述靶向Her
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2 CAR
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NK细胞施用给受试者，实现CAR修饰免疫细胞治疗。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤S2进一步包括下列步骤：S21.从患者体内获取血液，加入抗凝剂防止血液凝固；S22.用白细胞分离术以除去血液中的血小板和红细胞，获得外周血单核细胞(PBMC)；以及S23.从外周血单核细胞中分离出目标免疫效应细胞，通过进一步富集并激活免疫效应细胞，进行体外扩增培养。4.根据权利要求1至3中任一所述的靶向Her
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2 CAR
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NK应用于肿瘤治疗的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，刘昊，胡立强，谢尚志，
申请(专利权)人：杭州乾合细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：