一种透明质酸结合蛋白聚体及其在检测透明质酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种透明质酸结合蛋白二聚体及其在检测透明质酸中的应用。所述二聚体蛋白包括二个单体，其中每个单体包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区包含如SEQ ID NO:1所示的序列；所述第一蛋白功能区通过所述第二蛋白功能区形成二聚体形式。本发明专利技术的VG1二聚体蛋白的亲和力高于VG1单体及现有的TSG

【技术实现步骤摘要】
一种透明质酸结合蛋白聚体及其在检测透明质酸中的应用


[0001]本专利技术涉及生化检测领域，具体涉及一种透明质酸结合蛋白聚体及其在检测透明质酸中的应用。

技术介绍

[0002]透明质酸(HA)是一种结构简单但功能复杂的大分子糖胺聚糖，通常由2000～2500个葡萄糖醛酸-(β1-3)-N-乙酰葡糖胺二糖单位通过β1-4糖苷键形成分子量约为106～107的多聚物。透明质酸在生物界分布广泛，在人体中，透明质酸主要存在于皮肤、心脏、关节滑液和骨骼等部位，具有空间填充、润滑等多种功能。在恶性肿瘤中，透明质酸参与肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移及诱导肿瘤的多药耐药性等，在肿瘤发展和转移中起到重要作用。
[0003]HA是多种疾病重要的诊断指标。HA可反映肝脏内皮细胞功能及受损程度。肝硬化时HA增高水平与肝组织病理改变程度有密切关系。HA水平达250μg/L，可判定为肝硬化；HA水平达165μg/L，可作为慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎的分界；急性肝炎血清HA水平可有轻度升高。肝癌，HA明显增高。慢性肾炎及慢性肾功能不全血清HA水平明显升高，并与肌酐、尿素氮呈正相关。肺间皮细胞癌血清HA水平明显升高。作为膀胱肿瘤的标记物之一，通过检测尿液中HA的含量来辅助诊断膀胱肿瘤。HA还可应用于诊断银屑病。另外，近年来的研究证实透明质酸在肿瘤部位有过表达现象，因此透明质酸还可作为的恶性肿瘤的标记物，用于肿瘤的诊断。
[0004]目前市场上已有多种HA检测诊断试剂，其用于检测HA的活性成分为透明质酸结合蛋白(HABP)。HABP常规为牛鼻软骨提取Versican蛋白或者大肠杆菌表达的Versican蛋白片段。2005年，Seyfried第一次报道使用Drosophila expression system重组表达人Versican G1 domain(1-350aa of NP_001157569.1)，并实验确认其具有透明质酸结合功能(Seyfried,McVey et al.2005)。2011年，Clark在Escherichia coli BL21(DE3)pLysS cells系统中表达了与Seyfried相同碱基序列的VG1蛋白，但其为包涵体形式，且对HA检测的灵敏度较低。
[0005]CN104093415B公开了另一种重组HA结合蛋白，然而这种功能序列来自TSG-6。现有临床诊断中常用HABP常规为牛鼻软骨提取Versican蛋白或者大肠杆菌表达的Versican蛋白片段VG1。现有VG1蛋白的单体亲和力低，缺乏一种高亲和力的VG1蛋白。

技术实现思路

[0006]鉴于现有技术存在上述缺陷，本专利技术的目的在于提供一种新的透明质酸检测蛋白及其用途。本专利技术人在进行重组透明质酸酶结合蛋白开发时意外地发现，采用VG1和Fc表达形成融合蛋白(VG1-Fc)的情况下，比TSG-6-连接模块(LM)具有更高的亲和力、更好的特异性。另一方面，由于VG1-Fc的亲和力高、特异性好，无需Biotin标记即可达到市售试剂盒以及现有技术TSG-6-连接模块的灵敏度。基于VG1-Fc蛋白开发的试剂盒，可有效检测如血液、组织中的HA，为HA相关的研究提供新的选择。
[0007]针对现有技术的缺陷，本专利技术的技术方案之一为：一种结合透明质酸的二聚体蛋白，所述二聚体蛋白包括2个单体，其中每个单体包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区包含如SEQ ID NO:1所示的序列，或与其具有85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列；所述第一蛋白功能区通过所述第二蛋白功能区形成二聚体形式。
[0008]所述二个单体可以相同也可以不同，其中二个第一蛋白功能区可以相同也可以不同，而二个第二蛋白功能区可以相同也可以不同；在不同时，二个蛋白功能区的氨基酸序列具有85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性。
[0009]较佳地，所述第二蛋白功能区包含如SEQ ID NO:2所示的序列。优选地，所述第二蛋白功能区还包含如SEQ ID NO:8所示的序列。
[0010]较佳地，所述单体包含如SEQ ID NO:3所示的序列。优选地，所述单体包含如SEQ ID NO:4所示的序列。
[0011]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之二为：一种编码含上述任一项所述结合透明质酸的二聚体蛋白的单体的核酸分子。优选地，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列。
[0012]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之三为：一种表达载体，其包含如上所述的核酸分子。
[0013]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之四为：一种原核或真核宿主细胞，其包含如上所述的表达载体。优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
[0014]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之五为：如上任一项所述二聚体蛋白、如上所述核酸分子、如上所述表达载体或如上所述宿主细胞在制备疾病的体内诊断和治疗药物制剂和/或药物组合物中的应用。
[0015]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之六为：一种包括如上所述的透明质酸结合蛋白的检测试剂盒。
[0016]较佳地，所述检测试剂盒包含透明质酸降解酶。优选地，所述透明质酸降解酶为透明质酸酶。更优选地，所述透明质酸酶为Hyal1、Hyal2、Hyal3、哺乳动物睾丸透明质酸酶、透明质酸酶融合蛋白、所述透明质酸酶的变体和/或所述透明质酸酶的变体的修饰物。进一步优选地，所述透明质酸酶为人类睾丸透明质酸酶，所述人类睾丸透明质酸酶为序列如SEQ ID NO:9所示的PH20。
[0017]所述试剂盒应用于组织或者流体样品中透明质酸的检测，所述组织来源于人、鼠等物种。所述组织优选为人的基质组织。所述人的基质组织更优选为来自肿瘤的基质组织样品。所述流体包括血液、血清、尿液、汗液、精液、唾液、脑脊液或淋巴。
[0018]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之七为：一种透明质酸检测方法，一种透明质酸检测方法，其包括以下步骤：
[0019](1)取含透明质酸的样品；所述样品为基质组织样品或流体样品，所述基质组织优选来自肿瘤的基质组织样品，所述流体样品包括血液、血清、尿液、汗液、精液、唾液、脑脊液和/或淋巴样品；
[0020](2)使用如上所述的检测试剂盒检测所述样品。所述透明质酸检测方法优选还包括用显色液进行显色的步骤。所述显色液优选DAB。
[0021]较佳地，所述透明质酸检测方法还包括步骤(3)根据检测结果，对样品中的透明质酸含量进行定量或半定量分析。
[0022]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
[0023]本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0024]本专利技术的积极进步效果在于：
[0025]本专利技术提供一种新型的透明质酸结合蛋白，并提供了其在检测和定量生物学样品中透明质酸的应用，包含该蛋白的试剂盒可用于诊断和预估患者的病情发展、治疗效果及预后。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结合透明质酸的二聚体蛋白，其特征在于，所述二聚体蛋白包括二个单体，其中每个单体包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区包含如SEQ ID NO:1所示的序列；所述第一蛋白功能区通过所述第二蛋白功能区形成二聚体形式。2.如权利要求1所述的二聚体蛋白，其特征在于，所述第二蛋白功能区包含如SEQ ID NO:2所示的序列；优选地，所述第二蛋白功能区还包含如SEQ ID NO:8所示的序列。3.如权利要求1或2所述的二聚体蛋白，其特征在于，所述单体包含如SEQ ID NO:3所示的序列；优选地，所述单体包含如SEQ ID NO:4所示的序列。4.一种编码含权利要求1-3任一项所述结合透明质酸的二聚体蛋白的单体的核酸分子；优选地，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列。5.一种包含如权利要求4所述核酸分子的表达载体。6.一种包含如权利要求5所述表达载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。7.如权利要求1-3任一项所述的二聚体蛋白、如权利要求4所述的核酸分...

【专利技术属性】
技术研发人员：王征，叶亚文，徐云霞，
申请(专利权)人：苏州瑞安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：