本发明专利技术公开了一种新型蛋白制品电荷异质体的快速分离方法。该方法是使用等度洗脱的离子交换色谱法对蛋白制品中的电荷异质体进行分离，即用简单便捷的等度洗脱替代普遍应用的梯度洗脱，其优势有：显著加快分离速度，提高分析效率；简化实验流程，降低人力、物力成本；适用性广，同一方法可用于多种类似蛋白制品电荷异质体的分离分析。异质体的分离分析。
【技术实现步骤摘要】
一种基于等度洗脱的新型电荷异质体快速分离方法
[0001]本专利技术属于生物医药
，尤其涉及蛋白制品电荷异质体的分离分析，具体是指一种基于等度洗脱的离子交换色谱法快速分离蛋白制品的电荷异质体。
技术介绍
[0002]重组蛋白制品在其生产(包括细胞培养、纯化、制剂生产等环节)、存储、运输及使用过程中，各种因素使其蛋白表面会发生修饰、降解等，造成表面电荷的差异，使蛋白具有电荷异质性；另外，宿主细胞自身产生的及生产过程中引入的杂质，也会造成蛋白的异质性。然而，重组蛋白类药物的结构及药性会受到电荷异质体不同程度上的影响。因此，控制电荷异质体是评价重组蛋白制品生产工艺及其质量的重要因素。
[0003]离子交换色谱(IEC)是一种分离分析电荷异质体的有效且应用广泛的方法，同时，该色谱法也可以对蛋白质的特征进行定量及定性分析。研究人员利用离子交换色谱法对PD-1单克隆抗体的电荷异质体进行检测并收集，并结合其他表征手段研究抗PD-1的结构及生物学功能。离子交换色谱法多采用梯度洗脱，包括盐梯度和pH梯度；然而，无论是盐梯度还是pH梯度，梯度洗脱的方式均需要工作者探究梯度变化的条件，比如梯度变化时间、比例等，继而不断优化以达到良好的分离效果，这势必耗费大量的人力、物力及财力，尤其对于开发多个不同项目的企业或机构都是不利的。因此，对离子交换色谱检测方法的改进、优化势在必行。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于等度洗脱的新型电荷异质体的分离方法及其应用。分离蛋白制品电荷异质体的离子交换色谱法是依据带电荷的蛋白与带相反电荷固定相之间结合力的不同，从而达到分离的目的。基于等度洗脱的离子交换色谱法操作简便、分离效率高、重复性好、准确度高且适用性广。
[0005]本专利技术所提供的基于等度洗脱对蛋白质制品电荷异质体的分离方法，包括下述步骤：使用等度洗脱的离子交换色谱法对蛋白质制品中的电荷异质体进行分离。
[0006]所述蛋白质制品可为重组蛋白制品，所述重组蛋白制品包括PD-1抗体，所述PD-1抗体可为PD-1单克隆抗体或PD-1多克隆抗体，所述PD-1单克隆抗体具体可选自下述任一种：HL02及HL03。
[0007]所述HL02为Roche生产的曲妥珠单抗，商品名称为Herceptin；所述HL03为Roche生产的利妥昔单抗，商品名称为MabThera。
[0008]所述蛋白质制品可为蛋白质或蛋白质加工品。
[0009]所述蛋白质可为活性蛋白质或灭活蛋白质。
[0010]所述蛋白质可为天然蛋白质或人工蛋白质。
[0011]作为本专利技术的优选技术方案，所用流动相为90-110mM KH2PO4溶液，具体值为100mM。
[0012]优选地，使用NaOH调节所述流动相的pH值为6.00-6.20，具体值为6.10。
[0013]优选地，所述流动相的流速为0.45-0.55mL/min，具体值为0.5mL/min。
[0014]作为本专利技术的优选技术方案，所述离子交换色谱法中使用的离子交换色谱柱为带羧酸基团的阳离子交换色谱柱，具体的所述阳离子交换色谱柱可为BioLC ProPac WCX-10,4
×
250mm,10μm。
[0015]作为本专利技术的优选技术方案，所述离子交换色谱法采用的检测器为紫外检测器，检测波长为200-300nm，具体值为280nm。
[0016]优选地，所述离子交换色谱法中采用的色谱柱的温度为30-40℃，具体值为35℃。
[0017]优选地，所述离子交换色谱法中样品的进样体积为25-35uL，具体值为30uL。
[0018]优选地，所述离子交换色谱法中样品的进样浓度为2mg/mL。
[0019]本专利技术采用等度洗脱的方式进行离子交换，以分离蛋白制品的电荷异质体。与梯度洗脱相比，本专利技术具有以下优势：
[0020](1)分离速度快，出峰时间显著缩短；
[0021](2)分离效果好，与梯度洗脱具有相当的分离结果；
[0022](3)适用范围广，同时适用于其它PD-1产品的电荷异质体分离检测。
[0023]本专利技术采用一种新思路对单克隆抗体进行离子交换色谱检测，即以等度洗脱的方式代替传统的IEC梯度洗脱，这一方法显著地缩短了检测时间，提高了工作效率。与梯度洗脱相比，使用等度洗脱的方式不仅可以达到与之相当的分离效果，而且可使出峰时间缩短一倍；与此同时，也精简了实验准备过程，节省下一定的配置资源。另外，该法同时适用于其它PD-1产品项目的电荷异质体分离，这意味着等度洗脱的离子交换色谱法具有广泛应用的潜力。
附图说明
[0024]图1为PD-1蛋白制品(HL03)经等度洗脱后的色谱图；
[0025]图2为PD-1蛋白制品(HL03)经梯度洗脱后的色谱图；
[0026]图3为PD-1蛋白制品(HL02)经等度洗脱后的色谱图；
[0027]图4为PD-1蛋白制品(HL02)经梯度洗脱后的色谱图。
具体实施方式
[0028]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0029]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030]下述实施例中使用的PD-1蛋白制品HL02产自Roche公司，商品名称为Herceptin，生产批号N7282B06；HL03产自Roche公司，商品名称为MabThera，生产批号H0191B10。
[0031]实施例1：
[0032](1)样品的制备：HL02、HL03均用超纯水稀释至2mg/mL。稀释后的样品经0.22um滤
膜过滤，等待上机；
[0033](2)流动相的配制：配制100mM KH2PO4溶液，并用NaOH精确调节该溶液的pH值至6.10，经0.22um滤膜过滤，加贴标签待用；
[0034](3)使用步骤(2)中流动相，通过高效液相色谱仪对步骤(1)中的样品进行分离分析，色谱条件如下表所示：
[0035]表1 HPLC色谱参数——等度洗脱
[0036]高效液相系统Agilent 1260HPLC system色谱柱BioLC ProPac WCX-10,4
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250mm,10μm流速0.5mL/min紫外检测器波长280nm进样体积30μL柱温35℃样品盘温度8-12℃流动相100mM磷酸二氢钾，pH＝6.10洗脱方式等度洗脱洗脱时间40min
[0037]图1为HL03经等度洗脱后的色谱图。另外，表2给出了试样HL03梯度洗脱的色谱参数。图2为HL03经梯度洗脱后的色谱图，表3为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种蛋白质制品的电荷异质体的分离方法，包括下述步骤：使用等度洗脱的离子交换色谱法对所述蛋白质制品中的电荷异质体进行分离。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白质制品为重组蛋白质制品，所述重组蛋白制品包括PD-1单克隆抗体；具体的，所述PD-1单克隆抗体选自曲妥珠单抗和/或利妥昔单抗。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述离子交换色谱法中使用的流动相为90-110mM KH2PO4溶液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述流动相使用H3PO4调节其pH值为6.00-6.20。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述流动相的流速为0.45-0.55mL/...
【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，李永东，冯利伟，冯晓婷，王娇娇，毕利，王海旗，张中毅，
申请(专利权)人：华兰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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