抗ROR1抗体制造技术

本发明专利技术涉及识别受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的新抗体，以及使用这些抗体制备的双特异性ROR1/CD3结合蛋白，例如FIT

【技术实现步骤摘要】
抗ROR1抗体


[0001]本公开涉及能够识别受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的抗体。本文公开的抗体可用于治疗疾病，例如造血系统癌症和实体肿瘤。

技术介绍

[0002]受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)是一种进化上保守的I型膜蛋白，属于ROR亚家族。它与ROR家族的唯一一个另外的成员，ROR2，具有58％的氨基酸(aa)序列同一性。ROR1和ROR2由具有一个免疫球蛋白样(Ig样)结构域、一个卷曲(Fz)结构域和一个kringle(Kr)结构域的独特胞外区、以及随后的跨膜区和含酪氨酸激酶结构域的胞内区组成(Baskar,S.,et al,(2008)Clinical Cancer Research,14(2),396
‑
404)。
[0003]ROR1的表达受发育调节，在胎儿发育过程中衰减。对B细胞恶性肿瘤和正常B淋巴细胞的基因表达谱分析，揭示了ROR1及其在淋巴细胞白血病细胞中的独特表达(参见，Baskar等，2008，同上引文)。通过使用高灵敏度的鼠抗人ROR1 mAb 6D4，ROR1被表征为在某些类型的实体瘤，包括卵巢癌、三阴性乳腺癌、肺腺癌和胰腺癌中，具有典型的膜均一表达。此外，ROR1的细胞表面表达也在某些正常组织(如甲状旁腺、胰岛和人肠道的几个区域)中被观察到，但未见于其他组织(如脑、心脏、肺和肝脏)(Berger等,2016,Clinical Cancer Research,23(12),3061
–
3071)。
[0004]ROR1被提议为癌症治疗的靶点。例如，WO2005100605、WO2007051077、WO2008103849和WO2012097313描述了针对ROR1的抗体及其作为靶向肿瘤治疗剂的用途，所述肿瘤包括实体瘤如乳腺癌和造血系统肿瘤如慢性淋巴细胞白血病(CLL)。Cirmtuzumab，通过对WO2012097313的抗ROR1抗体D10所结合的表位进行作图而产生的一种人源化单克隆抗体，已用于多种癌症，包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)的临床试验中。Cirmtuzumab阻止ROR1与其配体Wnt5a结合，这可以抑制Wnt5a诱导的NF
‑
κB活化刺激作用，从而在CLL中抑制自分泌IL
‑
6依赖性STAT3激活(Chen等人，2019，Blood，134(13)，1084
–
1094)。Cirmtuzumab可以被内化到细胞中，因此评估了其作为抗ROR1抗体药物缀合物(ADC)的靶向部分的用途。开发了基于cirmtuzumab的、含MMAE的ADC，VLS
‑
101，用于治疗ROR1阳性恶性肿瘤患者。
[0005]针对ROR1和第二抗原的双特异性抗体，例如双特异性T细胞衔接器(bispecific T cell engager,BiTE)，是开发的另一种治疗模式。WO2014/167022公开一种双特异性抗体，其中一个臂是缓慢内化的抗ROR1抗体R12，另一个臂是抗CD3ε抗体。Gohil等人，2017(Onco Immunology,6(7),1
‑
11)使用靶向ROR1卷曲结构域的单链可变片段(scFv)，产生阻止小鼠模型中胰腺肿瘤异种移植物植入的BiTE。Qi等2018(Proceedings of the National Academy of Sciences of America,115(24),E5467
–
E5476)公开一种具有近膜表位的ROR1靶向性scFv，R11，当构建在scFv
‑
Fc形式中时，使用基于异二聚的无糖基化Fc结构域的ROR1 x CD3双特异性抗体，其表现出强有力的选择性抗肿瘤活性。
[0006]BiTE是针对T细胞/CD3复合物的恒定成分和肿瘤相关抗原(TAA)的双特异性抗体。这些双特异性抗体具有某些优势，例如以非MHC限制的方式将T细胞的细胞毒活性重定向到
恶性细胞。近年来，随着blinatumomab的临床成功，使用CD3靶向性BiTE进行癌症免疫治疗的兴趣日益增长。然而，已经出现与这种治疗方式的功效和毒性/安全性相关的问题。
[0007]对于严格肿瘤特异性的抗原，例如，可能期望具有增加的亲和力的抗体。然而，对于在肿瘤中过表达但也在正常组织中表达的肿瘤相关抗原，有利的是，抗体具有区分抗原在肿瘤中和在正常组织中的表达的能力。抗体的内化特性也对其治疗应用产生影响。对于抗体缀合物有效地将缀合的毒素递送到靶细胞中而言，例如，抗体结合后的强内化可能是合乎需要的。然而，内化作用对于T细胞衔接器则可能是不利的，对于通过T细胞结合来引发细胞毒性活性，可能期望的是将BiTE保持在细胞表面。此外，也已经显示，抗体药物的实体瘤渗透和功效受到抗体的亲和力和抗原内化的影响。根据Rudnick等人，2011(Rudnick等人，Cancer Res；71(6)；2250
‑
9)的报道，高亲和力和快速内化可限制抗体向肿瘤内部的渗透，而相对较低的亲和力和较低的内化可以导致更有效的实体瘤渗透。
[0008]许多因素已经在本领域中被提出影响BiTE的体内效力和肿瘤选择性。并且经常地，根据靶标/表位的性质，T细胞衔接器被期望采取不同的属性。
[0009]例如，James等(CD22特异性嵌合TCR的抗原敏感性受靶表位距细胞膜的距离调节，J.Immunol.180(10)(2008)7028
–
7038)描述了，通过调节表位距细胞膜的距离来提高BiTE的功效和/或肿瘤选择性。通过用CAR
‑
T细胞靶向与细胞膜具有不同距离的CD22表位，James等人发现，靶向中间结构域导致了靶标B细胞系的有效裂解，而未检测到正常B细胞的裂解。类似地，Qi等人发现，ROR1上的表位位置可以影响scFv
‑
Fc形式的ROR1 x CD3双特异性抗体的活性(参见Qi等人，2018，同上引文)。通过筛选一组在ROR1上具有不同表位的mAb，Qi等人的数据表明，对于双特异性抗体的T细胞衔接而言，R11所靶向的位于ROR1的Kr结构域中的近膜端表位可能是合适的位点，而R12所靶向的位于Fz和Kr结构域连接处的远膜端表位则可能不是。具有抗体R12臂的双特异性抗体仅显示出弱的体内抗肿瘤活性。
[0010]已经描述了通过改造抗体形式(包括大小、价态和几何形状)来增加肿瘤细胞的优先结合的不同方法。Slaga等人(基于亲合力的HER2结合导致抗HER2/CD3对HER2过表达细胞的选择性杀伤，Sci.Transl.Med.10(463)(2018))探索了一种多价抗体形式的基于亲合力的策略，并且开发了一种双特异性抗体，所述抗体的亲和力经选择可以增强对低密度HER2表达细胞和高密度HER2表达细胞的区分。G.L.Moore等人(一种工程化用于有效开发多种双特异性抗体形式的稳健异二聚体Fc平台，Methods(2018))报道了类似本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合ROR1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一组六个CDR，CDR
‑
H1、CDR
‑
H2、CDR
‑
H3、CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3，其中：CDR
‑
H1包含序列RSWMN(SEQ ID NO:1)；CDR
‑
H2包含序列RIYPGNGDIKYNGNFKG(SEQ ID NO:2)或RIYPGNADIKYNANFKG(SEQ ID NO:4)；CDR
‑
H3包含序列IYYDFYYALDY(SEQ ID NO:3)；CDR
‑
L1包含序列KASQDINKYIT(SEQ ID NO:5)；CDR
‑
L2包含序列YTSTLQP(SEQ ID NO:6)；和CDR
‑
L3包含序列LQYDSLLWT(SEQ ID NO:7)，任选地，其中CDR是根据Kabat编号定义的。2.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变域VH和轻链可变域VL，其中：VH结构域包含SEQ ID NO:8或17的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，和/或VL结构域包含SEQ ID NO:9的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列；或者VH结构域包含选自SEQ ID NOs:10
‑
12和21中任一项的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，和/或VL结构域包含选自SEQ ID NO:13
‑
16中任一项的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。3.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合或人源化抗体，可选地所述抗体是人源化抗体，进一步可选地，根据Kabat编号，所述抗体的VH结构域包含氨基酸残基1E、27Y和94H，以及选自38K、48I、66K和67A的0至4个残基；以及根据Kabat编号，所述VL结构域包含氨基酸残基71Y和选自4L、49H、58I和69R的0至4个残基。4.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含选自下组的VH和VL序列组合:组合VH序列VL序列1SEQ ID NO:8SEQ ID NO:92SEQ ID NO:17SEQ ID NO:93SEQ ID NO:10SEQ ID NO:134SEQ ID NO:10SEQ ID NO:145SEQ ID NO:10SEQ ID NO:156SEQ ID NO:10SEQ ID NO:167SEQ ID NO:11SEQ ID NO:138SEQ ID NO:11SEQ ID NO:149SEQ ID NO:11SEQ ID NO:1510SEQ ID NO:11SEQ ID NO:16
11SEQ ID NO:12SEQ ID NO:1312SEQ ID NO:12SEQ ID NO:1413SEQ ID NO:12SEQ ID NO:1514SEQ ID NO:12SEQ ID NO:1615SEQ ID NO:21SEQ ID NO:1316SEQ ID NO:21SEQ ID NO:1417SEQ ID NO:21SEQ ID NO:1518SEQ ID NO:21SEQ ID NO:16可选地，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:21序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:13序列的VL结构域。5.权利要求1
‑
4中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体具有以下一项或多项特征：(i)如在基于细胞的测定试验中测量的，在与表达ROR1的细胞(例如表达ROR1的骨髓瘤细胞系)的细胞表面结合后，抗体的内化不超过20％，可选地不超过15％，或14％、13％、12％、11％，其中内化可以通过与ROR1表达细胞(例如表达ROR1的骨髓瘤细胞系)的表面结合的抗体在37℃孵育两小时后，相对于保持在4℃相同时间的对照，通过流式细胞术检测的中位荧光强度(MFI)的降低百分比来反映；(ii)抗体在ROR1的Ig样结构域的C端结合人ROR1，并可选地与具有SEQ ID NO:42和43的VH/VL序列对的抗体竞争与ROR1结合；(iii)抗体与ROR1的结合诱导抗肿瘤活性，例如降低的肿瘤负荷/生长/细胞扩增。6.一种包含权利要求1
‑
5中任一项的分离的抗体或抗原结合片段的融合物或缀合物。7.一种编码权利要求1
‑
5任一项的分离的抗体或抗原结合片段的核酸分子。8.一种包含权利要求7的核酸分子的载体。9.一种宿主细胞，其表达编码权利要求1
‑
5中任一项的分离的抗体或抗原结合片段的核酸分子。10.一种药物组合物，其包含权利要求1
‑
5任一项的分离的抗体或抗原结合片段、权利要求6的融合物或缀合物、权利要求7的核酸分子、权利要求8的载体或权利要求9的宿主细胞。11.一种检测生物样品中ROR1的方法，包括使生物样品与权利要求1
‑
5任一项的分离的抗体或抗原结合片段或权利要求6的融合物或缀合物接触。12.一种特异性结合ROR1和CD3的双特异性结合蛋白，包含：a)特异性结合ROR1的第一抗原结合位点；和b)特异性结合CD3的第二抗原结合位点，其中第一抗原结合位点包含一组六个CDR，CDR
‑
H1、CDR
‑
H2、CDR
‑
H3、CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3，其中：CDR
‑
H1包含序列RSWMN(SEQ ID NO:1),CDR
‑
H2包含序列RIYPGNGDIKYNGNFKG(SEQ ID NO:2)或RIYPGNADIKYNANFKG(SEQ ID NO:4),CDR
‑
H3包含序列IYYDFYYALDY(SEQ ID NO:3),
CDR
‑
L1包含序列KASQDINKYIT(SEQ ID NO:5),CDR
‑
L2包含序列YTSTLQP(SEQ ID NO:6),和CDR
‑
L3包含序列LQYDSLLWT(SEQ ID NO:7),其中CDR根据Kabat编号定义，可选地，第一抗原结合位点包含如权利要求2
‑
4中任一项所定义的VH结构域和VL结构域。13.权利要求12的双特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点包含一组六个CDR，CDR
‑
H1、CDR
‑
H2、CDR
‑
H3、CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3，其中:CDR
‑
H1包含序列NYYVH(SEQ ID NO:25)；CDR
‑
H2包含序列WISPGSDNTKYNEKFKG(SEQ ID NO:26)；CDR
‑
H3包含序列DDYGNYYFDY(SEQ ID NO:27)；CDR
‑
L1包含序列KSSQSLLNARTRKNYLA(SEQ ID NO:28)；CDR

【专利技术属性】
技术研发人员：宫世勇，欧阳可栋，吴辰冰，吴丹青，巫玄，张瑞，
申请(专利权)人：上海岸迈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：