人源化BCMA抗体和BCMA-CAR-T细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种人源化BCMA单链可变片段(scFv)，该片段包括具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的VL。本发明专利技术还涉及一种BCMA嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白，其自N

【技术实现步骤摘要】
人源化BCMA抗体和BCMA
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CAR
‑
T细胞


[0001]本专利技术涉及人源化BCMA抗体和特异性减少多发性骨髓瘤生长，在过继免疫基因治疗肿瘤领域中有用的人源化BCMA
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CAR
‑
T细胞(PMC309含共刺激结构域CD28，PMC750含共刺激结构域4
‑
1BB)。

技术介绍

[0002]免疫疗法正在成为一种非常有前途的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原并将异常(癌症或经感染细胞)和正常细胞区分开来。利用CAR(嵌合抗原受体)构建体对T细胞进行基因修饰已成为设计肿瘤特异性T细胞最常见的方法。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR
‑
T细胞输入患者体内(称为过继细胞转移或ACT)是一种有效的免疫治疗方法[1,2]。与化疗或抗体相比，CAR
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T技术的优点在于经重新编程的工程化T细胞能在患者体内实现增殖和持续存在(“一种活的药物”)[1,2]。
[0003]CAR通常由在N
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末端部分的单克隆抗体来源的单链可变片段(scFv)、铰链、跨膜结构域和若干胞内共刺激结构域：(i)CD28，(ii)CD137(4
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1BB)、CD127或其它共刺激结构域，与CD3
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ζ结构域串联组成(图1)[2；3]。CAR的演变经历了从第一代(无共刺激结构域)到第二代(有一个共刺激结构域)再到第三代CAR(有若干个共刺激结构域)。具有多个共刺激结构域的CAR(所谓的第三代CAR)增强了细胞毒性CAR
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T细胞活性，显著改善CAR
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T细胞的持久性，从而增强其抗肿瘤活性。
[0004]图1示出了CAR的结构。左侧：第一代(无共刺激结构域)结构，中间：第二代(一个共刺激结构域CD28或4
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1BB)，右侧：第三代CAR(两个或若干个共刺激结构域)。该图来自Golubovskaya,Wu,Cancers,2016[3]。
[0005]BCMA
[0006]B细胞成熟抗原(BCMA)是一种细胞表面受体，又称CD269和肿瘤坏死因子受体超家族成员17(TNFRSF17)，由TNFRSF17基因编码。该受体主要在成熟的B淋巴细胞中表达，并在大多数多发性骨髓瘤(MM)中过表达[4]。现有用于治疗多发性骨髓瘤的靶向BCMA的疗法包括单克隆抗体、双特异性抗体和T细胞免疫疗法、CAR
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T疗法[4][5]。
[0007]BCMA结构和信号传导
[0008]人BCMA蛋白由184个氨基酸组成：1
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54
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胞外结构域；55
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77
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跨膜结构域；78
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184
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胞浆结构域。BCMA的氨基酸序列如图2所示。BCMA缺乏信号肽，并与其他受体诸如BAFF受体以及跨膜激活物和亲环素配体相互作用物和钙调节物(TACI)类似[5]。这些受体在B细胞成熟和分化为浆细胞中发挥重要作用。它们的配体包括在MM患者中表达增高的BAFF和APRIL[5]。单克隆抗体靶向受体
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配体相互作用，同时CAR
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T细胞疗法结合BCMA以杀伤MM细胞。BCMA还与TRAF1、2、3、5和6相互作用。

技术实现思路

[0009]为了给多发性骨髓瘤的提供新的治疗方法，本专利技术提供了一种人源化BCMA的单链
可变片段(scFv)，其包括具有SEQ ID NO:5所示氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:6所示氨基酸的VL。
[0010]在一些实施方式中，本专利技术的scFV进一步包括VH和VL之间的接头。
[0011]在具体实施方式中，本专利技术的scFV具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
[0012]另一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白，其自N
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末端到C
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末端包括：
[0013](i)本专利技术的scFv，
[0014](ii)跨膜结构域，
[0015](iii)至少一个共刺激结构域，和
[0016](iv)激活结构域。
[0017]在具体的实施方式中，所述共刺激结构域是CD28或4
‑
1BB。
[0018]在具体的实施方式中，所述激活结构域是CD3ζ。
[0019]在一个具体的实施方式中，本专利技术的CAR有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
[0020]在另一个具体的实施方式中，本专利技术的CAR具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
[0021]再一方面，提供了编码本专利技术的CAR的核酸。
[0022]又一方面，提供了一种经修饰以表达本专利技术的CAR的T细胞或自然杀伤细胞。CAR
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T细胞由于它们对肿瘤或病毒抗原的细胞毒活性，对靶标癌细胞具有特异性杀伤活性。
[0023]本专利技术基于靶向骨髓瘤BCMA的人源化BCMA
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CAR
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T细胞。人源化BCMA
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CAR
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T细胞的优势在于其拥有人源化BCMA scFv，由于scFv具有人序列，相比鼠scFv对人的免疫原性要低，在许多临床应用中极具潜力和优势。
附图说明
[0024]图1.示出了CAR的结构。
[0025]图2.示出了BCMA蛋白的氨基酸序列；胞外结构域标有下划线。
[0026]图3.示出了人源化BCMA CAR的结构。
[0027]图4.示出了人源化BCMA
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CAR
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T细胞杀伤CHO
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BCMA细胞但不杀伤CHO细胞。利用XCelligence实时细胞毒性分析检测人源化BCMA
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CAR
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T细胞的细胞毒性。Y轴表示归一化的细胞指数，X轴表示时间。上侧表示CHO
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BCMA靶细胞，下侧表示CHO靶细胞。右边从上到下是靶细胞、T细胞、模拟CAR
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T细胞和人源化BCMA CAR
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T细胞作为效应细胞。图5.示出了相比T细胞和模拟CAR
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T细胞，人源化BCMA
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CAR
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T细胞针对CHO
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BCMA
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阳性细胞分泌高水平的IFN
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γ，P<0.05。
[0028]图6.示出了基于抗小鼠F(ab)2m FAB和荧光标记的BCMA蛋白，利用FACS对9天的扩增期间的hBCMA
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CAR
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T细胞(PMC750)进行检测，表明有高百分比的CAR
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源化BCMA的单链可变片段(scFv)，其包括具有SEQ ID NO:5所示氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:6所示氨基酸的VL。2.权利要求1所述的scFv，进一步包括VH和VL之间的接头。3.权利要求2所述的scFv，其具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。4.一种嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白，其自N
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末端到C
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末端包括：(i)权利要求1所述的scFv，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴力军，维塔，
申请(专利权)人：普洛迈博生物技术公司，
类型：发明
国别省市：