人源化CD37和双特异性CD19-人源化CD37CAR-T细胞制造技术

本发明专利技术涉及含本发明专利技术的人源化CD37

【技术实现步骤摘要】
人源化CD37和双特异性CD19
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人源化CD37 CAR
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T细胞


[0001]本专利技术涉及人源化CD37 CAR和双特异性CD19
‑
人源化CD37
‑
CAR和CAR
‑
T细胞，它们在血液系统肿瘤的过继免疫基因治疗领域中是有用的。

技术介绍

[0002]免疫疗法正在成为一种非常有前途的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原并将异常(癌症或经感染细胞)和正常细胞区分开来。利用CAR(嵌合抗原受体)构建体对T细胞进行基因修饰已成为设计肿瘤特异性T细胞最常见的方法。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR
‑
T细胞输入患者体内(称为过继细胞转移或ACT)是一种有效的免疫治疗方法[1,2]。与化疗或抗体相比，CAR
‑
T技术的优点在于经重新编程的工程化T细胞能在患者体内实现增殖和持续存在(“一种活的药物”)[1,3]。
[0003]CAR通常由在N
‑
末端部分的单克隆抗体来源的单链可变片段(scFv)、铰链、跨膜结构域和若干胞内共刺激结构域：(i)CD28，(ii)CD137(4
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1BB)、CD127或其它共刺激结构域，与CD3
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ζ结构域串联组成(图1)[1；2]。CAR的演变经历了从第一代(无共刺激结构域)到第二代(有一个共刺激结构域)再到第三代CAR(有两个共刺激结构域)和第四代(有若干个共刺激结构域)。具有多个共刺激结构域的CAR(所谓的第三代CAR)增强了细胞毒性CAR
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T细胞活性，显著改善CAR
‑
T细胞的持久性，从而增强其抗肿瘤活性。
[0004]CAR的结构示于图1。左侧：第一代(无共刺激结构域)结构，中间：第二代(一个共刺激结构域CD28或4
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1BB)，右侧：第三代CAR(两个或若干个共刺激结构域)。该图来自Golubovskaya,Wu,Cancers,2016[3]。
[0005]CD19和CD37抗原
[0006]CD19是一种已知的在B细胞恶性肿瘤(诸如白血病和淋巴瘤)中过表达的抗原。CD37是跨膜四蛋白(或跨膜4超家族(TM4SF)蛋白)家族蛋白中的成员，该家族蛋白具有四个潜在的跨膜区，CD37在白血病和淋巴瘤患者中也过表达[4]。

技术实现思路

[0007]为了提供新的免疫肿瘤的治疗方法，本专利技术提供了一种人源化CD37 scFv，其包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。
[0008]在一些实施方案中，人源化scFv具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
[0009]此外，本专利技术提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包括：
[0010](i)权利要求1所述的人源化CD37 ScFv，
[0011](ii)跨膜结构域，
[0012](iii)至少一个共刺激结构域，和
[0013](iv)激活结构域。
[0014]在一些实施方案中，嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
[0015]此外，本专利技术提供了双特异性CAR，其包括：
[0016](i)具有SEQ ID NO:5的氨基酸的CD19 V
L
，
[0017](ii)权利要求1所述的人源化CD37 ScFv，
[0018](iii)具有SEQ ID NO:6的氨基酸的CD19 V
H
，
[0019](iv)跨膜结构域，
[0020](v)至少一个共刺激结构域，和
[0021](vi)激活结构域。
[0022]在一些实施方案中，双特异性CAR具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
[0023]在一些实施方案中，嵌合抗原受体或双特异性CAR中的所述共刺激结构域是CD28或4
‑
1BB。
[0024]在一些实施方案中，嵌合抗原受体或双特异性CAR中的所述激活结构域是CD3ζ。
[0025]此外，本专利技术提供了核酸序列，其编码本专利技术的嵌合抗原受体或双特异性CAR。
[0026]此外，本专利技术提供了T细胞，其经修饰以表达本专利技术的嵌合抗原受体或双特异性CAR。
[0027]此外，本专利技术提供了自然杀伤细胞，其经修饰以表达本专利技术的嵌合抗原受体或双特异性CAR。
[0028]本专利技术的CAR对于血液系统肿瘤的过继免疫基因治疗领域中是有用的。
附图说明
[0029]图1、CAR的结构。
[0030]图2、构建体结构。A：人源化CD37
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CAR构建体的结构；B：双特异性CD19
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人源化CD37
‑
CAR构建体的结构。
[0031]图3、使用抗小鼠FAB抗体通过FACS检测CAR
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阳性细胞。转导后9天抗小鼠(mFAB)或人F(ab)2(hFAB)抗体检测到>40％的CAR
‑
T细胞。
[0032]图4、人源化CD37特异性杀伤CHO
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CD37靶细胞并分泌高水平的IFN
‑
γ。A：人源化CD37特异性杀伤CHO
‑
CD37靶细胞；B：人源化CD37分泌高水平的IFN
‑
γ。
[0033]图5、使用抗小鼠FAB抗体通过FACS检测CAR+细胞。在用PMC930CD19
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hCD37 CAR慢病毒转导T细胞后9天，FAB抗体检测到约50％的CAR
‑
阳性细胞。
[0034]图6、CD19
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CD37
‑
CAR
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T细胞特异地杀伤Hela
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CD19细胞和CHO
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CD37靶细胞。A：使用CD19
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hCD37
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CAR
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T细胞和Hela
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CD19靶细胞的杀伤试验；B：使用CD37抗原呈阳性的CHO
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CD37的靶细胞杀伤试验。
[0035]图7、CD19
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hCD37
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CAR
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T细胞杀伤CD19和CD37阳性的Raji淋巴瘤细胞。
[0036]图8、与Hela
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CD19、CHO
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CD37细胞和Raji细胞一起培养时，CD19
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hCD37
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CAR
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T细胞分泌的IFN
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γ。A：与CD19阳性Hela
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CD19细胞一起培养时，CD19
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人源化CD37 scFv，其包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。2.权利要求1所述的人源化scFv，其具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。3.嵌合抗原受体(CAR)，其包括：(i)权利要求1所述的人源化CD37 ScFv，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。4.权利要求3所述的嵌合抗原受体，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。5.双特异性CAR，其包括：(i)具有SEQ ID NO:5的氨基酸的CD19 V
L
，(ii)权利要求1所述的人源化CD37 ScFv，(iii)具有SEQ ID NO:6的氨基酸的CD19 V
H...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴力军，维塔，
申请(专利权)人：普洛迈博生物技术公司，
类型：发明
国别省市：