倒千里光碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种倒千里光碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。所述倒千里光碱的半抗原的结构式如式I所示，可按照下述方法制备得到：在4

【技术实现步骤摘要】
倒千里光碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种倒千里光碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用，属于食品安全检测领域。

技术介绍

[0002]倒千里光碱是吡咯里西啶类生物碱的一种。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，倒千里光碱在3类致癌物清单中。吡咯里西啶类生物碱是诸多开花植物的次生代谢物，是目前已知的继马兜铃酸后的最重要的植物毒性成分，是影响牲畜、野生动物和人类的天然毒素。咯里西啶类生物碱主要分布在菊科、紫草科和豆科等植物中，其主要的靶器官为肝脏，可引起肝细胞出血性坏死、肝巨红细胞症及静脉闭塞症等，此外还具有肺脏毒性，致癌作用，致突变作用和神经毒性等。因吡咯里西啶类生物碱分布广泛，可以通过间接的食物污染如蜂蜜、谷物、牛奶、牧草等的污染或者直接通过含吡咯里西啶类生物碱的传统草药、滋补品、茶等对人类或牲畜生命造成极大的毒害。
[0003]针对吡咯里西啶类生物碱在人类食品及天然药物中的广泛存在和危害，许多国家或组织制定了相应的法规。我国新版药典中一些中药品种确实含有吡咯里西啶类生物碱。除了个别品种(如千里光)，在质量标准中加强了有毒成分的控制，对于具有药食兼用的品种，相关研究则更少。现存的检测动植物食品中吡咯里西啶类生物碱的方法主要是仪器方法，包括高效液相色谱、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-串联质谱法等，虽然色谱技术能够进行定性定量、高效率，高灵敏度的检测，但此类方法不能实现现场检测，难以推广普及。相较于色谱技术，基于抗原抗体的特异性结合，具有灵敏、快速、特异、简便等优点，近年来已广泛应用到食品安全检测中。
[0004]目前吡咯里西啶类生物碱的免疫学检测大多为仪器检测，而国内有关吡咯里西啶类生物碱检测试剂盒的开发还相对落后。因此设计免疫半抗原分子，开发一种简单、快捷、用于多种倒千里光碱检测的抗体显得尤为重要；更是为我国进出口食品中吡咯里西啶类有毒生物碱快速检测提供理论和技术依据，保障食品安全和人类健康。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种倒千里光碱半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。
[0006]本专利技术所提供的倒千里光碱半抗原，其结构式如式Ⅰ所示：
[0007][0008]所述倒千里光碱半抗原可按照下述制备方法制备：
[0009]在4-二甲氨基吡啶的催化下，倒千里光碱与琥珀酸酐进行反应即得。
[0010]具体地，所述倒千里光碱与所述4-二甲氨基吡啶摩尔比为1：1～2；
[0011]所述倒千里光碱与所述琥珀酸酐的摩尔比为1：1.2～1.5；
[0012]所述反应温度室温(25℃左右)，所述反应时间为4～5h。
[0013]所述反应在二氯甲烷中进行；
[0014]反应结束后，可通过硅胶柱收集，然后在35℃氮气下吹干。
[0015]本专利技术还提供了一种倒千里光碱人工抗原，由所述倒千里光碱半抗原与载体蛋白偶联后得到；
[0016]所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和钥孔血蓝蛋白中任一种，优选牛血清白蛋白或卵清蛋白。
[0017]所述倒千里光碱半抗原与所述载体蛋白的偶联摩尔比约为5：1；
[0018]所述倒千里光碱人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。
[0019]可采用活泼酯法将所述载体蛋白偶联于所述半抗原的羧基碳上得到所述倒千里光碱人工抗原，具体步骤为：将所述倒千里光碱半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌过夜，得到A液；取所述载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，得到B液；逐滴将所述A液滴入所述B液中，室温搅拌反应过夜，得到偶联物的混合液；混合液在PBS中透析三天，得到所述倒千里光碱人工抗原。
[0020]所述倒千里光碱半抗原或所述倒千里光碱人工抗原具有下述应用：
[0021]1)制备抗倒千里光碱抗体；
[0022]2)检测食品或药品中倒千里光碱的残留。
[0023]本专利技术还提供了一种倒千里光碱的单克隆抗体，通过所述倒千里光碱人工抗原免疫实验动物(雌性BALB/c小鼠)，经过细胞融合、筛选和体外诱生得到。
[0024]所述倒千里光碱的单克隆抗体可用于制备倒千里光碱检测试剂或试剂盒。
[0025]所述倒千里光碱的单克隆抗体具有下述应用：
[0026]1)倒千里光碱的免疫检测；
[0027]2)倒千里光碱免疫层析试纸条的制备；
[0028]3)倒千里光碱的胶体金检测试纸条的制备。
[0029]本专利技术提供了倒千里光碱半抗原、人工抗原及其制备方法，采用所述倒千里光碱人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高并且可以同时识别倒千里光碱(ReRTSrsine,
RTS)、阔叶千里光碱(Platyphylline,PLA)、千里光宁碱(Senecionine,SEN)、全缘千里光碱(Integerrimine,INT)、迷迭香宁碱(Rosmarinine,ROS)、春生千里光碱(Senecivernine,SEV)、新阔叶千里光碱(Neoplatyphylline,NEO)、菊三七胺(Gynuramine,GYN)、野百合碱(Monocrotaline,MCT)的广谱性抗体。本专利技术提供的倒千里光碱半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏的同时检测多种吡咯里西啶类生物碱残留的方法提供了新手段。
[0030]本专利技术提供的半抗原制备方法简单，与载体蛋白的偶联物制备的单克隆抗体抗体对RTS、PLA、SEN、INT、ROS、SEV、NEO、CYN、MCT的检测灵敏度可分别达0.86、0.75、0.43、0.59、19.32、56.32、129.34、184.61、1003.95ng/mL，实用价值高。本专利技术在食品安全检测中具有良好的应用前景。
附图说明
[0031]图1为制备本专利技术式I所示倒千里光碱半抗原的反应方程式。
[0032]图2为本专利技术式I所示倒千里光碱半抗原的质谱图。
[0033]图3为本专利技术半抗原与牛血清白蛋白偶联的MALDI-TOF-MS图，其中，图3(A)为牛血清白蛋白的MALDI-TOF-MS图，图3(B)为偶联物的MALDI-TOF-MS图。
[0034]图4为本专利技术利用单克隆抗体检测9种倒千里光碱的标准曲线图，其中，图4(A)-图4(I)依次表示检测RTS、SEN、INT、PLA、SEV、ROS、CYN、NEO、MCT的标准曲线。
具体实施方式
[0035]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037]下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH 7.4、0.01M的PBS缓冲液，碳酸盐缓冲液均为pH 9.6、0.05本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.式I所示倒千里光碱半抗原；2.权利要求1所述倒千里光碱半抗原的制备方法，包括如下步骤：在4-二甲氨基吡啶的催化下，倒千里光碱与琥珀酸酐进行反应即得。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述倒千里光碱与所述4-二甲氨基吡啶摩尔比为1：1～2；所述倒千里光碱与所述琥珀酸酐的摩尔比为1：1.2～1.5；所述反应温度室温，所述反应时间为4～5h；所述反应在二氯甲烷中进行。4.一种倒千里光碱人工抗原，由权利要求1所述倒千里光碱半抗原与载体蛋白偶联后得到；所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和钥孔血蓝蛋白中任一种。5.权利要求4所述倒千里光碱人工抗原的制备方法，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：江海洋，沈建忠，王战辉，于雪芝，郑丕苗，史为民，温凯，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：