一种电融合缓冲液、其制备方法及电融合方法技术

本发明专利技术提供了一种电融合缓冲液以及电融合细胞的方法，可以大幅提高杂交瘤技术的细胞融合效率和细胞存活率。本发明专利技术优化了电融合缓冲液比例，该缓冲液不但具有低导电率，还解决了对细胞串珠排列时的干扰和细胞融合实验的热效应问题，提高了克隆形成率，降低实验成本。降低实验成本。

【技术实现步骤摘要】
一种电融合缓冲液、其制备方法及电融合方法


[0001]本专利技术属于杂交瘤细胞生产应用的
，具体涉及一种低导电率的缓冲液以及电融合细胞的方法。

技术介绍

[0002]杂交瘤技术又称为单克隆抗体技术，主要是制备对抗原特异的单克隆抗体，将免疫动物的B淋巴细胞（通常为免疫动物的脾细胞）与骨髓瘤细胞进行融合，可以得到能产生抗体、不断增殖的杂交瘤细胞，进而可以大量的生产单克隆抗体。虽然杂交瘤技术是生产单克隆抗体的重要基础，但是该技术的实验步骤繁琐、周期长，且影响实验成功与否的因素众多，其中便是杂交瘤的制程。融合后初产生的杂交瘤容易受到环境微小变化影响，极其容易夭折；而即使杂交瘤细胞生长良好，也有可能因为杂交瘤细胞无法分泌特异性抗体而导致整个实验失败，且易增加实验成本。
[0003]为了提升克隆化效率，提高得到特异性抗体的成功率，得到抗体的高产量，现有技术针对了杂交瘤细胞的培养基进行调整，CN103865880A公开了一种培养基及其制备方法，包括1640完全培养基和添加重组人IL
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21，可以促进新生成的杂交瘤细胞生长，且同时增强杂交瘤细胞分泌特异性抗体的能力。然而，这样的方法是待杂交瘤细胞生成后再改良其培养环境，若是细胞融合出的杂交瘤细胞存活数量少或生成效率差，可能也会发生上述实验失败的情形。因此，如何提高细胞融合效率和细胞存活率会是一大关键。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的旨在提高细胞融合效率和细胞存活率，优化细胞电融合实验条件，提供了一种电融合缓冲液的配方以及电融合方法。该缓冲液不但具有低导电率，还解决了强导电率对对象细胞造成的损伤，并且对细胞质具有一定的保护作用，最大程度降低了对细胞串珠排列时的干扰和细胞融合实验的热效应。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种电融合缓冲液，其特征在于，所述电融合缓冲液包含以下成分：0.2~0.3M D
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山梨糖醇、0.1~0.3mM乙酸镁、0.1~0.2mM乙酸钙和0.5~2 mg/mL牛血清白蛋白。
[0006]优选地，本专利技术所述的电融合缓冲液，其特征在于，包含以下成分：0.3M D
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山梨糖醇、0.1mM乙酸镁、0.1mM乙酸钙和1 mg/mL牛血清白蛋白。
[0007]在一实施方案中，本专利技术提供一种电融合缓冲液，其特征在于，所述电融合缓冲液包含D
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山梨糖醇、乙酸镁、乙酸钙和牛血清白蛋白，所述D
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山梨糖醇、乙酸镁、乙酸钙和牛血清白蛋白的质量比为36.4~54.6：0.0214~0.0642：0.0158~0.0316 ：0.5~2。
[0008]更优选地，本专利技术任一项所述的电融合缓冲液，其特征在于，所述电融合缓冲液pH值为6.8~7.2。
[0009]更优选地，本专利技术任一项所述的电融合缓冲液于杂交瘤技术或单克隆抗体技术中应用。
[0010]在一实施方案中，本专利技术提供上述任一项电融合缓冲液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：（1）将D
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山梨糖醇分散到纯水中得到第一溶液；（2）将牛血清白蛋白加入第一溶液中，得到第二溶液；（3）将乙酸镁加入第二溶液中，得到第三溶液；（4）将乙酸钙加入第三溶液中，过滤后得到所述电融合缓冲液。
[0011]优选地，本专利技术所述的制备方法，其特征在于，所述电融合缓冲液充分溶解并混合均匀后，调整pH值至6.8~7.2。
[0012]在一实施方案中，本专利技术提供一种电融合细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：（1）将骨髓瘤细胞与脾细胞以1∶2~1∶5的数量比例混合；（2）将步骤（1）的细胞重悬浮于权利要求1
‑
3中任一项所述的电融合缓冲液中；（3）将步骤（2）的细胞悬液加入电融合仪的融合室；（4）施加交流电压；（5）施加两个直流电脉冲，并在后一个直流脉冲后，再次施加交流电压；（6）将电融合后的细胞悬液移至HAT培养基，并加入铺有饲养细胞的96孔板中进行培养筛选。
[0013]优选地，本专利技术所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）的细胞悬液为1
×
107个细胞/mL。
[0014]优选地，本专利技术所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）的交流电压参数为：交流电场30 V、50 V，交流电场频率2 MHz，持续作用时间20秒。
[0015]优选地，本专利技术所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）的两个直流电脉冲参数为：直流脉冲电压400 V、800 V，作用时间0.5秒。
[0016]优选地，本专利技术所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）的交流电压参数为：交流电场50 V、交流电场频率0.8 MHz，持续作用时间7秒。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的电融合缓冲液有益效果在于：（1） 大幅提升细胞融合率或提高克隆形成率，有利于杂交瘤的选择。
[0018]（2） 降低对细胞串珠排列时的干扰和细胞融合实验的热效应，减少对细胞的损伤，提升细胞存活率。
[0019]（3） 提升杂交瘤技术实验成功率，降低成本。
[0020]（4） 成本远远低于市售电融合缓冲液产品。
具体实施方式
[0021]以下结合具体实施例对本专利技术做进一步的描述，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围，并不是唯一性限定。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本专利技术中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本专利技术的保护范围。
[0022]本文中使用的所有技术和科学术语具有被本专利技术所属领域技术人员普遍理解的
相同含义。在其他情况下，本文使用的某些术语会在说明书中阐明其含义。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识，或按照制造厂商所建议的条件。如无特别说明，实施例所用的所有材料和试剂均为市售产品。本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0023]电融合缓冲液是影响电融合的主要因素，渗透压和成分等均会影响电融合的效果。电融合可在倒置显微镜下直接观看融合现象，便于有目的地控制选择融合条件。
[0024]本专利技术提供一种电融合中的缓冲液，其特性包括：（1）解离充分，解决了强导电率对对象细胞造成的损伤，大幅降低了对细胞串珠排列时的干扰，以及细胞融合实验的热效应。
[0025]（2）牛血清白蛋白（BSA）为细胞提供营养物质，具有保护细胞质的功用，提高了细胞融合时的效率和细胞存活率。
[0026]（3）提高克隆形成率，有利于杂交瘤的选择。
[0027]下面将结合实施例来详细说明本专利技术。
[0028]实施例1：高、低浓度电融合缓冲液的配置与其细胞融合效率本专利技术高、低浓度的电融合缓冲液配置如下：A． 低浓度方案：0.2M D
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山梨糖醇、0.1mM乙酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种电融合缓冲液，其特征在于，所述电融合缓冲液包含以下成分：0.2~0.3M D
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山梨糖醇、0.1~0.3mM乙酸镁、0.1~0.2mM乙酸钙和0.5~2 mg/mL牛血清白蛋白。2. 根据权利要求1所述的电融合缓冲液，其特征在于，包含以下成分：0.3M D
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山梨糖醇、0.1mM乙酸镁、0.1mM乙酸钙和1 mg/mL牛血清白蛋白。3.一种电融合缓冲液，其特征在于，所述电融合缓冲液包含D
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山梨糖醇、乙酸镁、乙酸钙和牛血清白蛋白，所述D
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山梨糖醇、乙酸镁、乙酸钙和牛血清白蛋白的质量比为36.4~54.6：0.0214~0.0642：0.0158~0.0316：0.5~2。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的电融合缓冲液，其特征在于，所述电融合缓冲液pH值为6.8~7.2。5.根据权利要求1
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3中任一项所述的电融合缓冲液于杂交瘤技术或单克隆抗体技术中应用。6.权利要求1
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3中任一项所述的电融合缓冲液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：（1）将D
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山梨糖醇分散到纯水中得到第一溶液；（2）将牛血清白蛋白加入第一溶液中，得到第二溶液；（3）将乙酸镁加入第二...

【专利技术属性】
技术研发人员：许行尚，杰弗瑞，
申请(专利权)人：南京岚轩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：