一种BNP重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种BNP重组蛋白及其制备方法和应用，该制备方法包括以下步骤：S1重组质粒、转化与培养：将具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列的BNP重组质粒转化至BLR(DE3)菌，培养获得活化菌株，然后1:1000接种到LB培养基中，恒温振荡培养，进行摇瓶实验，诱导，离心得菌体；S2纯化：将所述步骤S1中离心得到的菌体沉淀进行细胞裂解，获得上清，His柱过柱纯化，260mM咪唑洗脱获得BNP重组蛋白。BNP重组质粒转化大肠杆菌，进行BNP重组蛋白的表达，获得BNP重组蛋白，与天然BNP蛋白相同的免疫原性，而且纯度高，有更好的稳定性，可代替天然BNP多肽，用作BNP免疫诊断试剂标准品和BNP检测试剂盒。检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种BNP重组蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种BNP重组蛋白的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]心脏病在许多国家已成为头号杀手，因其早期症状隐蔽，患者往往被延误治疗。BNP(B 型钠尿肽又称脑利钠肽)作为心衰定量标志物，是一种在心室当中合成的具有生物学活性的神经激素，主要在心室表达，同时也存在于脑组织中。当左心室功能不全时，由于心肌扩张而快速合成释放入血，有助于调节心脏功能。心肌细胞所分泌的BNP先以108个氨基酸组成的前体蛋白形式存在，当心肌细胞受到刺激时，前体蛋白在活化酶的作用下裂解为由76个氨基酸组成的无活性的直线多肽和32个氨基酸组成的活性环状多肽，释放入血循环，分别被称为NT
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proBNP和BNP。因而BNP和NT
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proBNP在评估心脏事件时较其他钠尿肽要好，能够单独地预示左室(LV)舒张末期压力增高的状况，能更好地反映和分析慢性心衰病人的状况。
[0003]目前BNP与NT
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proBNP的检测已经被广泛应用于急性冠脉综合征、CHF患者危险及稳定性冠状动脉疾病患者心脏事件危险的评价、监控左心室功能不全患者的治疗、探查轻度心功能不全等方面。与NT
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proBNP相比，BNP具有受年龄和肾功能的影响小的特点，对心脏功能的判断更为特异，具有统一的cut
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off值(临界值)。除此之外，BNP检测的主要优势还在于：能够快速、准确、高质量地对心脏衰竭进行诊断。
[0004]目前BNP的定量检测方法已经相对广泛，必不可少检测标准品。由于BNP的分子量仅有3.5KD，在体内降解速度较快，在血液中半衰期约20分钟。人体内BNP极低，无法从血浆(血清)中纯化，天然多肽制备十分困难。而直接多肽合成成本过高，且多肽存在不稳定、保存困难等问题。
[0005]因此，有必要研发出一种新的BNP重组蛋白及其制备方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是，提供一种BNP重组蛋白，能够克服效率低易降解的缺陷，具有较好的活性、免疫原性及高度的稳定性。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，该BNP重组蛋白，具有SEQ ID NO： 1所示的氨基酸序列。
[0008]SEQ ID NO：1为：
[0009]Met Gly Val Asp Trp Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp ArgIle Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His Trp Ser Pro Lys Met Val Gln Gly SerGly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg ArgHis Trp Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser SerGly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His Trp Leu Asp His His His His His His。
[0010]本专利技术解决的另一个技术问题是，将上述SEQ ID NO：1的BNP重组蛋白在免疫诊断中的应用。
[0011]本专利技术的BNP重组蛋白具有与天然BNP蛋白相同的免疫原性，而且纯度高，有更好的稳定性。
[0012]优选的，所述的BNP重组蛋白用作BNP免疫诊断试剂标准品。
[0013]优选的，所述的BNP重组蛋白用于制备BNP检测试剂盒。
[0014]本专利技术解决的另一个技术问题是，提供一种上述SEQ ID NO：1的BNP重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0015]S1重组质粒、转化与培养：将具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列的BNP 重组质粒转化至BLR(DE3)菌，培养获得活化菌株，然后1:1000接种到LB培养基中，恒温振荡培养，进行摇瓶实验，诱导，离心得菌体；
[0016]S2纯化：将所述步骤S1中离心得到的菌体沉淀进行细胞裂解，获得上清，His柱过柱纯化， 260mM咪唑洗脱获得BNP重组蛋白。
[0017]BNP重组质粒转化大肠杆菌，进行BNP重组蛋白的表达，获得BNP重组蛋白，具有与天然BNP蛋白相同的免疫原性，而且纯度高，有更好的稳定性，上清表达，纯化简单，可代替天然BNP多肽，用作BNP免疫诊断试剂标准品和BNP检测试剂盒。
[0018]优选的，在所述步骤S1中，培养获得活化菌株的温度为37℃；恒温振荡培养的温度为 37℃。
[0019]优选的，在所述步骤S2中，获得的BNP重组蛋白进行BCA浓度测定，浓度1.2mg/mL；获得的BNP重组蛋白进行纯度测定，SDS电泳大于90％，目的大小为13KD。
[0020]优选的，在所述步骤S2中，获得的BNP重组蛋白进行活性测定，配制权利要求3中的标准品；稀释液包括有20mMPB、4％BSA、5％海藻糖和10％山梨醇，PH＝7.4；配制完成后利用免疫层析试纸条测定活性。
[0021]优选的，在所述步骤S1中，采用PCR技术将表达BNP的目的基因扩增，色氨酸W连接BNP序列，三次重复，获得所述BNP重组质粒核苷酸序列对应的氨基酸序列。
[0022]PCR技术属于现有技术，属于本领域技术人员所熟知的技术。
[0023]传统提取BNP重组蛋白方法具有成本高、收率低，目的蛋白容易变性，材料来源有限等诸多缺陷。用基因工程制备低分子量多肽，一般采用融合蛋白表达，能克服单独表达低分子量多肽时出现的翻译效率低表达产物易受蛋白水解酶降解的缺陷，但较大的标签蛋白对小分子蛋白的免疫原性有一定的影响。所以通常使用一些蛋白酶切除标签蛋白，切除标签后的蛋白需要进一步纯化和去除加入的蛋白酶，操作比较麻烦并且蛋白酶十分昂贵。
具体实施方式
[0024]本实施例的BNP重组蛋白，具有选自于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
[0025]将上述具有选自于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的BNP重组蛋白在免疫诊断中的应用，所述的BNP重组蛋白用作BNP免疫诊断试剂标准品，以及所述的BNP重组蛋白用于制备 BNP检测试剂盒。
[0026]本实施例的具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的BNP重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0027]S1重组质粒、转化与培养：将具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列的BNP 重组质粒转化至BLR(DE3)菌(货号：HG
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VDN0207；厂家：长沙艾碧维生物科技有限本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种BNP重组蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。2.权利要求1所述的BNP重组蛋白在免疫诊断中的应用。3.根据权利要求2所述的BNP重组蛋白在免疫诊断中的应用，其特征在于，所述的BNP重组蛋白用作BNP免疫诊断试剂标准品。4.根据权利要求2所述的BNP重组蛋白在免疫诊断中的应用，其特征在于，所述的BNP重组蛋白用于制备BNP检测试剂盒。5.一种权利要求1的BNP重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1重组质粒、转化与培养：将具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列的BNP重组质粒转化至BLR(DE3)菌，培养获得活化菌株，然后1:1000接种到LB培养基中，恒温振荡培养，进行摇瓶实验，诱导，离心得菌体；S2纯化：将所述步骤S1中离心得到的菌体沉淀进行细胞裂解，获得上清，His柱过柱纯化，260mM咪唑洗脱获得BNP重组蛋白。6.根据权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：许行尚，杰弗瑞，
申请(专利权)人：南京岚轩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：