一株分泌2,4-D单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株分泌2,4

【技术实现步骤摘要】
一株分泌2,4
‑
D单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术涉及食品安全免疫检测领域，尤其是涉及一株分泌2,4
‑
D单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

技术介绍

[0002]2,4
‑
D(2,4
‑
二氯苯氧乙酸)，是人工合成、类似于生长素的一种植物生长调节剂、除草剂，主要作为有机除草剂在农业中使用。它能扰乱植物体内激素平衡，广泛应用于水稻、小麦、高粱、甘蔗、玉米等单子叶作物的生产中，防治阔叶杂草。另外，2,4
‑
D还可以作为水果和蔬菜的防腐剂，延长其保质期。由于其成本低，2,4
‑
D的使用逐年增加。因此，对人和环境的危害也在增加。喷洒在土壤表面的除草剂渗入土壤，污染地下水和地表水。同时，它很容易通过皮肤和呼吸进入人体，导致中毒。
[0003]为了有效监督监测食品中使用2,4
‑
D的情况，需要寻找一种特异性好，灵敏度高的测定方法，而目前相关技术中，检测方法如薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法等，分离纯化过程冗长，灵敏度低，加上食品中干扰物多，难以获得准确结果。因此建立快速简便的2,4
‑
D检测方法具有重要意义。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一株2,4
‑
D单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对2,4
‑
D具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立2,4
‑
D的免疫学检测方法。
[0005]本专利技术的技术方案，一株2,4
‑
D单克隆抗体杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.22332。
[0006]本专利技术的另一目的是提供2,4
‑
D单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCC No.22332的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0007]本专利技术的又一目的是提供2,4
‑
D单克隆抗体的制备方法，由2,4
‑
D原药与蛋白的偶联物免疫小鼠后获得。
[0008]本专利技术的再一目的是提供一种所述2,4
‑
D单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中2,4
‑
D残留的分析检测。
[0009]本专利技术第五个目的是提供一种试剂盒，该试剂盒包含所述的2,4
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D单克隆抗体。
[0010]本专利技术第六个目的是提供一种试剂盒，应用在检测2,4
‑
D含量中，进一步地，用于食品安全检测中2,4
‑
D的分析检测。
[0011]本专利技术提供的分泌2,4
‑
D单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备基本步骤为：
[0012](1)完全抗原的制备：
[0013]a、免疫原2,4
‑
D
‑
BSA的制备：2,4
‑
D药物的化学结构中具有羧基官能团，可直接作为半抗原与蛋白进行偶联，具体操作如下：称取1mg 2,4
‑
D原药(2,4
‑
D原药和牛血清白蛋白(BSA)摩尔比为30:1)，1.56mg N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μL N,N
‑
二甲基甲酰胺
(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取2.6mg 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到2,4
‑
D原药溶液中，室温搅拌反应6
‑
8h(称为A液)。取牛血清白蛋白BSA 10mg，加入3mL硼酸缓冲溶液(称为B液)，在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物2,4
‑
D
‑
BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原；
[0014]b、包被原2,4
‑
DB
‑
OVA的制备：2,4
‑
DB与2,4
‑
D相比，具有更长的间隔臂，药物的化学结构中也具有羧基官能团，可直接与蛋白进行偶联，具体操作如下：称取3.3mg 2,4
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DB，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐7.6mg，N
‑
羟基琥珀酰亚胺4.6mg，用400μL无水N,N
‑
二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反4
‑
5h。称取10mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于4mL硼酸缓冲溶液中，在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物2,4
‑
DB
‑
OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原。
[0015](2)小鼠的免疫：2,4
‑
D
‑
BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用2,4
‑
D
‑
BSA完全抗原(不含佐剂)冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic
‑
ELISA)检测血清效价和抑制；
[0016](3)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic
‑
ELISA)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic
‑
ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得分泌2,4
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D单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0017]本专利技术的有益效果：本专利技术所制备的杂交瘤细胞株能够有效分泌2,4
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D的单克隆抗体，对2,4
‑
D具有较好的特异性和检测灵敏度，IC
50
值为1.7ng/mL，可实现对水、果蔬、谷物中2,4
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D残留量的检测，为食品中2,4
‑
D残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
[0018]生物材料样品保藏：一株分泌2,4
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D单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株XSMS，保藏编号为CGMCC No.22332，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
[0019]附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分泌2,4
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D单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株XSMS，保藏编号CGMCC No.22332，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.一种2,4
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D单克隆抗体，其特征在于，它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.22332的杂交瘤细胞株分泌产生。3.如权利要求2所述的2,4
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D单克隆抗体的制备方法，其特征在于，由2,4
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D原药与蛋白的偶联物免疫小鼠后获得。4.一种2,4
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D单克隆抗体，其特征在于，有权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴爱红，潘晓敏，胥传来，匡华，徐丽广，马伟，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：