一种去甲乌药碱半抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种去甲乌药碱人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用，属于食品安全免疫检测领域，以去甲乌药碱与丁二酸酐反应得到具有羧基的产物为半抗原，用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联，得到完全抗原，用紫外法测定偶联物的偶联比，并得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株，此细胞株分泌的单克隆抗体，对去甲乌药碱具有较好的特异性和检测灵敏度，IC

【技术实现步骤摘要】
一种去甲乌药碱半抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用


[0001]本专利技术属于食品安全免疫检测领域，具体涉及一种去甲乌药碱半抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。

技术介绍

[0002]去甲乌药碱(HG)是一种植物性的苄基四氢异喹啉类生物碱，这种天然化合物是从各种亚洲药用植物中提取出来的，是乌头，附子，莲子心等中药材中的强心活性成分，因此可以加工成一些功能性食品和添加剂。然而，HG是一种具有显着抗氧化、抗炎、镇痛和抗肿瘤作用的β
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2肾上腺素能激动剂，能够刺激β受体通过减少血小板黏附，抑制iNOS和上调HO
‑1的表达，对心血管产生正力，正时性作用。因为服用含有HG的产品的运动员可能会导致心率和氧气摄入量的加速增加，使其运动水平高于正常水平。从2020年开始被世界反兴奋剂机构(WADA)将其列为S3类永久禁用药物。WADA将运动员尿样中HG含量≥10ng/mL作为阳性结果的检出限，因此需要一种能够快速、准确和可靠的检测方法来定量检测食品或药物中的HG。
[0003]相关技术中，关于HG的常用的检测方法有高效液相色谱
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紫外(HPLC
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UV)法，高效液相色谱
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荧光(HPLC
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FLD)法，高效液相色谱
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质谱(HPLC
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MS)法等。其中常规的HPLC
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UV法灵敏度偏低；柱前衍生荧光法改善了灵敏度但增加误差步骤，但设备复杂，对专业操作人员的要求高，有机溶剂用量高，严重限制了其在实验室以外作业中的应用。
[0004]酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种极为高效、灵敏、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在药物残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测去甲乌药碱的前提是得到对去甲乌药碱具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备去甲乌药碱具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

技术实现思路

[0005]为解决相关技术中存在的问题，找到一种对去甲乌药碱具有高特异性和高灵敏度的检测手段，本专利技术的一个目的是提供一株分泌去加乌药碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2020年09月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株LNTD 2E8，保藏编号为CGMCC No.20793，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006]本专利技术的另一目的是提供一种去甲乌药碱半抗原、完全抗原的制备方法，该制备方法用于免疫分析简单有效，为后续研究提供了方便的途径。
[0007]本专利技术的又一目的是提供一种去甲乌药碱单克隆抗体，应用在去甲乌药碱的检测中，对去甲乌药碱具有良好的特异性和检测灵敏度(IC50值为10ng/mL)。
[0008]本专利技术的再一目的是提供一种试剂盒，包含所述杂交瘤细胞株，或所述去甲乌药碱单克隆抗体，可实现对中药材及功能性食品中去甲乌药碱残留量的检测。
[0009]具体技术方案：
[0010]作为本专利技术的第一个方面，提供一株分泌去加乌药碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2020年09月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株LNTD 2E8，保藏编号为CGMCC No.20793，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0011]作为本专利技术的第二个方面，提供一种半抗原，用于制备所述的杂交瘤细胞株，所述半抗原具有以下式(1)和式(2)两种分子结构：
[0012][0013][0014]作为本专利技术的第三个方面，提供一种去甲乌药碱单克隆抗体，有所述的保藏编号为CGMCC No.20793的杂交瘤细胞株分泌产生；或者由所述的半抗原与BSA或KLH蛋白的偶联物免疫小鼠后获得。
[0015]在一种可选的实施例中，所述半抗原由以下方法获得：
[0016]将去甲乌药碱和4
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二甲氨基吡啶溶解在无水吡啶中，然后加入丁二酸酐，将混合物在40～60℃，回流得到沉淀物；
[0017]在旋转蒸发器中干燥沉淀物，并将其溶解在甲醇/水中；
[0018]再用乙酸乙酯萃取后，收集有机相，加入冰盐酸反应，可见清澈的白色沉淀物；
[0019]将沉淀物干燥，即可得到两种分子结构的半抗原。
[0020]在本专利技术的优选实施例中，所述半抗原由以下方法获得：
[0021]将5mg～50mg去甲乌药碱(HG)和1.5mg～5mg 4
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二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在2mL无水吡啶中，然后加入10～25mg丁二酸酐，混合物在60℃回流12h，得到沉淀物；
[0022]在旋转蒸发器中干燥沉淀物，并将其溶解在2mL 50％的甲醇/水中；
[0023]用乙酸乙酯萃取3次后，收集有机相，加入10％冰盐酸(v/v)，在4℃下反应2h，可见清澈的白色沉淀物；
[0024]将沉淀物转移到烘箱中，并在60℃下加热至干燥，即可得到两种带有羧基结构的半抗原HG。
[0025]作为本专利技术的第四个方面，提供所述杂交瘤细胞株或去甲乌药碱单克隆抗体在检测去甲乌药碱中的应用。
[0026]在一种可选的实施案例中，所述杂交瘤细胞株或去甲乌药碱单克隆抗体用于分析检测中药材和功能性食品中的去甲乌药碱残留。
[0027]在本专利技术的可选实施案例中，去甲乌药碱完全抗原由以下方法获得：
[0028]1)将去甲乌药碱半抗原、1
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乙基碳二亚胺盐酸盐和N
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羟基琥珀酰亚胺，用无水N，N
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二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反12h，得到A液；
[0029]2)将血蓝蛋白(KLH)或者牛血清蛋白(BSA)，硼酸缓冲溶液稀释，得到称为B液；
[0030]3)在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应后，得到C液；然后用PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到KLH去甲乌药碱完全抗原(HG
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HS
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KLH)或BSA去甲乌药碱完全抗原(HG
‑
HS
‑
BSA)。
[0031]在本专利技术的可选实施案例中，分泌去加乌药碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，主要由以下方法获得：
[0032]S1：将去甲乌药碱完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫，进行首次免疫和多次加强免疫：首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天；
[0033]S2：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中去甲乌药碱抗体含量高的获得免疫的小鼠；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分泌去加乌药碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2020年09月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株LNTD 2E8，保藏编号为CGMCC No.20793，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.一种半抗原，用于制备权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述半抗原具有以下式(1)和式(2)两种分子结构：3.一种去甲乌药碱单克隆抗体，其特征在于，所述去甲乌药碱单克隆抗体是由权利要求1所述的所述的保藏编号为CGMCC No.20793的杂交瘤细胞株分泌产生；或者由权利要求2所述的半抗原与BSA或KLH蛋白的偶联物免疫小鼠后获得。4.一种如权利要求3所述的去甲乌药碱单克隆抗体，其特征在于，所述半抗原由以下方法获得：将去甲乌药碱和4
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二甲氨基吡啶溶解在无水吡啶中，然后加入丁二酸酐，将混合物在40
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽强，周升阳，胥传来，匡华，徐丽广，孙茂忠，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，郝昌龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：