鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株的制备方法技术

本发明专利技术公开了鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株的制备方法，涉及基因工程技术领域，包括以下步骤：步骤S1：制备前的准备工序，菌株和细菌株的准备；试验动物的准备；试剂和仪器的准备；步骤S2：动物免疫，药剂的准备；多点注射；再次注射；分离血清；检测血清的效价；步骤S3：细胞融合；步骤S4：细胞制备；步骤S5：完成；步骤S6：后续检测；步骤S7：总结。本发明专利技术具备了通过使用OmpA结构蛋白，OmpA是一种保守性良好的结构蛋白，具有很强的免疫原性和免疫反应性，本研究通过杂交瘤技术，成功制备了能够稳定分泌抗鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，各血清间具有有效的交叉保护的效果。各血清间具有有效的交叉保护的效果。各血清间具有有效的交叉保护的效果。

【技术实现步骤摘要】
鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株的制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体为鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株的制备方法。

技术介绍

[0002]鸭疫里默氏杆菌是革兰氏阴性，需氧，短杆菌。鸭疫里默氏杆菌感染又称为鸭传染性浆膜炎，是感染家禽最重要的细菌性传染病之一，本病对一至八周龄的鸭易感，感染鸭会出现精神沉郁，绿色腹泻，眼鼻有浆液性分泌物的情况，部分呈现神经症状，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和干酪性输卵管炎为特征，是死亡率高的传染性败血症，对养鸭业造成较大的经济损失。
[0003]除感染鸭外，鸭疫里默氏杆菌还可以感染鸡、火鸡、鹅等禽类，鸭疫里默氏杆菌的血清型众多，世界范围内已报道了二十一种血清型，其中血清一、二、六和十型是国内主要流行血清型，各血清型间缺乏有效的交叉保护。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株的制备方法，具备了通过使用OmpA结构蛋白，OmpA是一种保守性良好的结构蛋白，具有很强的免疫原性和免疫反应性，本研究通过杂交瘤技术，成功制备了能够稳定分泌抗鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，各血清间具有有效的交叉保护的效果，解决了上述
技术介绍
中所提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株的制备方法，包括以下步骤：
[0006]步骤S1：制备前的准备工序，菌株和细菌株的准备；试验动物的准备；试剂和仪器的准备；
[0007]步骤S2：动物免疫，药剂的准备；多点注射；再次注射；分离血清；检测血清的效价；
[0008]步骤S3：细胞融合，取免疫后3天的小鼠，摘除小鼠的眼球并进行采血作为阳性血清；将小鼠处死之后，分离小鼠的脾脏细胞，并按5:1的比例与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行混合；
[0009]步骤S4：细胞制备，1.5天后用HAT培养基换出一半培养基，7天后用HT培养基换出HAT培养基，观察杂交瘤细胞生长情况，待其生长至孔底面积的10％以上时，取细胞培养上清测定抗体效价，以OmpA蛋白包被酶标板(1μg/孔)，HRP标记的羊抗鼠IgG+IgM(H+L)作二抗，健康小鼠的血清作为阴性对照，根据抗体效价筛选阳性反应的杂交瘤细胞，分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞使用有限稀释法亚克隆至阳性单克隆100％，将杂交瘤细胞传代培养10代；亚克隆作业；
[0010]步骤S5：完成，OmpA超免后的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行SP2/0融合后，经间接ELISA法筛选出阳性融合细胞，成功融合的杂交瘤细胞经3次亚克隆后获得1株杂交瘤细
胞，命名为4H8，传代10代后的4H8杂交瘤细胞的培养上清效价基本保持一致，表明该杂交瘤细胞能稳定分泌抗体；
[0011]步骤S6：后续检测，抗体细胞株的稳定性检测；抗体的腹水制备及效价检测；单克隆抗体亚型测定；单克隆抗体的特异性鉴定；单克隆抗体的染色体分析；
[0012]步骤S7：总结。
[0013]可选的，所述步骤S1中的菌株和细菌株的准备包括鸭疫里默氏杆菌血清1型分离株JS2、鸭疫里默氏杆菌血清2型分离株NT6、鸭疫里默氏杆菌血清10型分离株SD3、大肠杆菌血清型O78菌株E19、大肠杆菌血清型O2菌株E72，大肠杆菌血清型O1菌株E26，上述均为自行分离鉴定菌株；鸡白痢菌株CVCC519、禽伤寒菌株CVCC3384、巴氏杆菌株CVCC493、骨髓瘤细胞(SP2/0)。
[0014]可选的，所述步骤S1中的试验动物的准备为BALB/c小鼠。
[0015]可选的，所述步骤S1中的试剂和仪器的准备包括蛋白电泳仪、蛋白转印槽、二氧化碳培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、超低温冰箱、小鼠单克隆抗体分型试剂盒、蛋白分子质量标准、胎牛血清、青链霉素双抗、PRMI 1640、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。
[0016]可选的，所述步骤S2中的药剂的准备为将纯化后的OmpA蛋白与完全弗氏佐剂进行1:1的混合，并经乳化器充分乳化。
[0017]可选的，所述步骤S2中的多点注射是以100μg的免疫剂量对8周龄的雌性BALB/c小鼠进行皮下多点免疫注射，每隔两周注射相同的免疫剂量，以进行第二次和第三次加强免疫。
[0018]可选的，所述步骤S2中的再次注射是对小鼠第二、三次免疫注射时，采用纯化后的OmpA与不完全弗氏佐剂进行混合后并进行乳化。
[0019]可选的，所述步骤S2中的分离血清是在第三次加强免疫后两周，取小鼠眼眶后静脉的血液并分离出血清。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0021]一、本专利技术制备出鸭疫里默氏杆菌OmpA特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株4H8，Western blot法结果表明该单克隆抗体与鸭疫里默氏杆菌血清1型、血清2型和血清10型菌株发生特异性反应，而与其他禽类致病菌如禽大肠杆菌、禽伤寒、鸡白痢和禽巴氏杆菌无交叉反应，该杂交瘤细胞能够稳定产生单克隆抗体。
[0022]二、本专利技术通过单克隆抗体的特异性鉴定，得到4H8腹水与鸭疫里默氏杆菌血清1型、2型和10型菌株均呈特异性阳性反应，与沙门菌、大肠杆菌及巴氏杆菌不存在交叉反应，证明研制的单克隆抗体具有很强的种属特异性。
[0023]三、本专利技术通过抗体细胞株的稳定性检测，得到该杂交瘤细胞株稳定性良好。
附图说明
[0024]图1为本专利技术结构的工艺流程图。
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]实施例一：
[0027]请参阅图1，本专利技术提供一种技术方案：该鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株的制备方法使用时，包括以下步骤：
[0028]步骤S1：制备前的准备工序，菌株和细菌株的准备；试验动物的准备；试剂和仪器的准备。
[0029]步骤S2：动物免疫，药剂的准备；多点注射；再次注射；分离血清；检测血清的效价，检测血清的效价为采用间接ELISA法检测血清效价，选效价最高的小鼠进行第四次加强免疫，免疫原剂量是初次免疫的二倍且不使用弗氏佐剂佐剂，72h内进行细胞融合。
[0030]步骤S3：细胞融合，取免疫后3天的小鼠，摘除小鼠的眼球并进行采血作为阳性血清；将小鼠处死之后，分离小鼠的脾脏细胞，并按5:1的比例与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行混合，放入75mL的离心管中，1600r/min进行离心3min，之后去除上清液，将离心管置39℃水浴中，在70s间缓慢匀速的滴加39℃预热的PEG 1450mL，加毕在39℃的水浴中静置80s，再加入39℃预热的无血清RPMI1640培养液终止融合的作用，750r/min离心5min，并弃去上清液，细胞沉淀用39℃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤S1：制备前的准备工序，菌株和细菌株的准备；试验动物的准备；试剂和仪器的准备；步骤S2：动物免疫，药剂的准备；多点注射；再次注射；分离血清；检测血清的效价；步骤S3：细胞融合，取免疫后3天的小鼠，摘除小鼠的眼球并进行采血作为阳性血清；将小鼠处死之后，分离小鼠的脾脏细胞，并按5:1的比例与骨髓瘤细胞进行混合；步骤S4：细胞制备，1.5天后用HAT培养基换出一半培养基，7天后用HT培养基换出HAT培养基，观察杂交瘤细胞生长情况，待其生长至孔底面积的10％以上时，取细胞培养上清测定抗体效价，以OmpA蛋白包被酶标板，HRP标记的羊抗鼠IgG+IgM作二抗，健康小鼠的血清作为阴性对照，根据抗体效价筛选阳性反应的杂交瘤细胞，分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞使用有限稀释法亚克隆至阳性单克隆100％，将杂交瘤细胞传代培养10代；亚克隆作业；步骤S5：完成，OmpA超免后的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行SP2/0融合后，经间接ELISA法筛选出阳性融合细胞，成功融合的杂交瘤细胞经3次亚克隆后获得1株杂交瘤细胞，命名为4H8，传代10代后的4H8杂交瘤细胞的培养上清效价基本保持一致，表明该杂交瘤细胞能稳定分泌抗体；步骤S6：后续检测，抗体细胞株的稳定性检测；抗体的腹水制备及效价检测；单克隆抗体亚型测定；单克隆抗体的特异性鉴定；单克隆抗体的染色体分析；步骤S7：总结。2.根据权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的菌株和细菌株的准备包括鸭疫里默氏杆菌血清1型分离株JS2、鸭疫里默氏杆菌血清2型分离株NT6、鸭疫里默氏杆菌血清10型分离株S...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱善元，于圣青，董洪燕，吴植，封琦，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：