新型AAV衣壳和含有其的组合物制造技术

本文提供新型AAV衣壳和包含其的rAAV。在一个实施例中，相比于现有技术AAV，采用新型AAV衣壳的载体展示增加的所选靶组织的转导。AAV衣壳的载体展示增加的所选靶组织的转导。AAV衣壳的载体展示增加的所选靶组织的转导。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型AAV衣壳和含有其的组合物

技术介绍

[0001]腺相关病毒(AAV)在人类基因疗法中具有广阔的前景，且由于其能够提供长期基因表达且缺乏致病性，因此在各种研究中已广泛用于靶向肝脏、肌肉、心脏、脑、眼睛、肾脏和其它组织。AAV属于细小病毒家族，且每个都含有单股DNA，两侧是两个反向末端重复序列。已经报道了数十种天然存在的AAV衣壳；其独特衣壳结构使其能够识别和转导不同的细胞类型和器官。
[0002]自1981年开始第一次试验以来，基于AAV载体的基因治疗的临床试验中没有报告任何与载体相关的毒性。AAV载体在临床试验中不断积累的安全记录，结合已证明的功效，表明AAV是一个有前景的基因递送平台。另一个有吸引力的特征是AAV相对容易操纵，因为它是一种单股DNA病毒，具有小基因组(～4.7kb)和简单的遗传成分
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反向末端重复序列(ITR)以及Rep和Cap基因。AAV载体中只需要ITR和AAV衣壳蛋白，其中ITR作为载体生产的复制和包装信号，且衣壳蛋白不仅形成衣壳以容纳载体基因组DNA，而且决定组织向性以将载体基因组递送到靶细胞和组织。
[0003]由于AAV的低免疫原性和非致病性，AAV是基因疗法最有效的候选载体之一。然而，尽管允许有效的基因转移，但目前在临床中使用的AAV载体可能会受到对病毒的预先存在的免疫力和限制的组织向性的阻碍。需要新的和更有效的AAV载体。

技术实现思路

[0004]在一个实施例中，本文提供一种重组腺相关病毒(rAAV)，其具有包含衣壳蛋白的AAV衣壳，所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO：2(AAVrh.91)的氨基酸序列，且在衣壳中包装有包含异源核酸序列的载体基因组。在某些实施例中，rAAV具有包含衣壳蛋白的衣壳，所述衣壳蛋白通过SEQ ID NO：1或3的AAV衣壳序列，或与SEQ ID NO：1或3具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的序列的表达产生，且在衣壳中包装有包含异源核酸序列的载体基因组。
[0005]在某些实施例中，本文提供rAAV，其中AAV衣壳包含AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白包含：(1)选自以下的AAVrh.91 vp1蛋白的异质群体：通过由编码SEQ ID NO：2的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列的表达产生的vp1蛋白、由SEQ ID NO：1或3产生的vp1蛋白、或由与SEQ ID NO：1或3具有至少70％一致性的核酸序列产生的vp1蛋白，所述核酸序列编码SEQ ID NO：2的1至736的预测氨基酸序列；选自以下的AAVrh.91 vp2蛋白的异质群体：通过由编码SEQ ID NO：2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列的表达产生的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：1或3的至少核苷酸412至2208的序列产生的vp2蛋白、或由与SEQ ID NO：1或3的至少核苷酸412至2208具有至少70％一致性的核酸序列产生的vp2蛋白，所述核酸序列编码SEQ ID NO：2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列；选自以下的AAVrh.90 vp3蛋白的异质群体：通过由编码SEQ ID NO：2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列的表达产生的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：1或3的至少核苷酸607至2208的序列产生的vp3蛋白、或由与SEQ ID NO：1或3的至少核苷酸607至2208具有至少70％
一致性的核酸序列产生的vp3蛋白，所述核酸序列编码SEQ ID NO：2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列；和/或(2)作为编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群体、作为编码SEQ ID NO：2的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群体和作为编码SEQ ID NO：2的至少氨基酸203至736的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群体，其中：vp1、vp2和vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群，所述氨基酸修饰包含SEQ ID NO：2中的天冬酰胺
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甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)；并且任选地进一步含有包含其它脱酰胺化的氨基酸的亚群，其中所述脱酰胺化引起氨基酸变化。
[0006]在另一实施例中，本文提供一种组合物，其至少包含rAAV和生理学上相容的载剂、缓冲剂、佐剂和/或稀释剂。在某些实施例中，组合物被调配成用于鞘内递送，且载体基因组包含编码用于递送至中枢神经系统的基因产物的核酸序列。在另一实施例中，组合物被调配成用于静脉内递送、鼻内和/或肌肉内递送。
[0007]在某些实施例中，提供一种适用于产生rAAV的系统。所述系统包含：(a)编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核酸序列；(b)适合于包装至AAV衣壳中的核酸分子，其中所述核酸分子包含至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列，所述核酸序列与引导所述产物在宿主细胞中的表达的序列可操作地连接；和(c)允许将核酸分子包装至rAAV衣壳中的足够AAV rep功能和辅助功能。
[0008]在某些实施例中，提供一种产生包含AAV衣壳的rAAV的方法。所述方法包含培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞含有：(a)编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的AAV衣壳蛋白的核酸分子；(b)功能rep基因；(c)包含AAV 5
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ITR、AAV 3
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ITR和转基因的小基因；和(d)允许将所述小基因包装到AAV衣壳中的足够辅助功能。
[0009]在又一实施例中，提供含有本文所述的rAAV、表达盒或核酸分子的宿主细胞。
[0010]在某些实施例中，提供将转基因递送到细胞的方法。所述方法包括使细胞与如本文所述的rAAV接触的步骤，其中rAAV包含转基因。
[0011]这些组合物和方法的其它方面和优点在以下具体实施方式中进一步描述。
附图说明
[0012]图1示出用于AAV
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SGA工作流程的图。从恒河猴组织样本分离基因组DNA并且针对AAV衣壳基因的存在进行筛选。对AAV阳性DNA进行终点稀释且进行另一轮PCR。根据泊松分布，在不超过30％的孔中产生PCR产物的DNA稀释液在80％的时间内每个阳性PCR含有一个可扩增的DNA模板。使用Illumina MiSeq 2x150或2x250配对末端测序平台对阳性扩增子进行测序，并使用SPAdes组装器从头组装所得读段。
[0013]图2是示出新型AAV天然分离物和代表性进化枝对照的DNA基因组序列的相邻连接系统发生的图。
[0014]图3A
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图3D示出AAVrh.91(SEQ ID NO：1)、AAVrh.91eng(SEQ ID NO：3)、AAV6.2(SEQ ID NO：5)和AAV1(SEQ ID NO：7)衣壳的核酸序列的比对。
[0015]图4A和图4B示出AAVrh.91(SEQ I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组腺病毒相关病毒(rAAV)，其具有包含衣壳蛋白的AAV衣壳，所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO：2(AAVrh.91)的氨基酸序列，且在所述衣壳中包装有包含异源核酸序列的载体基因组。2.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其具有包含衣壳蛋白的衣壳，所述衣壳蛋白通过SEQ ID NO：1或3的AAV衣壳序列，或与SEQ ID NO：1或3具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的序列的表达产生，且在所述衣壳中包装有包含异源核酸序列的载体基因组。3.根据权利要求1或2所述的rAAV，其中所述衣壳蛋白由SEQ ID NO：1或3编码。4.根据权利要求1至3中任何一项所述的rAAV，其进一步包含5
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AAV反向末端重复序列(ITR)和3
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AAV ITR以及与调节序列可操作地连接的异源核酸序列，所述调节序列引导由所述异源核酸序列编码的产物在靶细胞中的表达。5.根据权利要求4所述的rAAV，其中所述AAV ITR序列来自除AAVrh.91以外的AAV。6.根据权利要求5所述的rAAV，其中所述ITR序列来自AAV2。7.根据权利要求2至6中任一项所述的rAAV，其中所述AAV衣壳包含AAV衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含：(1)选自以下的AAVrh.91 vp1蛋白的异质群体：通过由编码SEQ ID NO：2的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列的表达产生的vp1蛋白、由SEQ ID NO：1或3产生的vp1蛋白、或由与SEQ ID NO：1或3具有至少70％一致性的核酸序列产生的vp1蛋白，所述核酸序列编码SEQ ID NO：2的1至736的预测氨基酸序列；选自以下的AAVrh.91vp2蛋白的异质群体：通过由编码SEQ ID NO：2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列的表达产生的vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：1或3的至少核苷酸412至2208的序列产生的vp2蛋白、或由与SEQ ID NO：1或3的至少核苷酸412至2208具有至少70％一致性的核酸序列产生的vp2蛋白，所述核酸序列编码SEQ ID NO：2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列；选自以下的AAVrh.91vp3蛋白的异质群体：通过由编码SEQ ID NO：2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列的表达产生的vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：1或3的至少核苷酸607至2208的序列产生的vp3蛋白、或由与SEQ ID NO：1或3的至少核苷酸607至2208具有至少70％一致性的核酸序列产生的vp3蛋白，所述核酸序列编码SEQ ID NO：2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列；和/或(2)作为编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群体、作为编码SEQ ID NO：2的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群体和作为编码SEQ ID NO：2的至少氨基酸203至736的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群体，其中：vp1、vp2和vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群，所述氨基酸修饰包含SEQ ID NO：2中的天冬酰胺
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甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)，并且任选地进一步含有包含其它脱酰胺化的氨基酸的亚群，其中所述脱酰胺化引起氨基酸变化。8.根据权利要求7所述的rAAV，其中编码所述蛋白质的所述核酸序列为SEQ ID NO：1或3，或与SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州大学信托人，
类型：发明
国别省市：