一段来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一段来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列，其长度为101碱基，其序列为SEQ ID NO.3所示序列。此外，本发明专利技术还公开了该段来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列的筛选方法，包括如下步骤：第一步，通过重测序技术从囊型包虫病病人血样中得到大量游离DNA序列；第二步，通过生物信息学方法分析比对从中筛选出来源于细粒棘球绦虫的虫源游离DNA序列；第三步，再通过荧光定量PCR方法在包虫病病人和健康人中验证后筛选得到。另外，本发明专利技术还公开了该游离DNA序列在制备包虫病诊断和检测产品中的应用。检测结果显示该游离DNA序列在包虫病病人检测中具有较高的敏感性和特异性，在包虫病诊断和检测领域有很好的应用前景。断和检测领域有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一段来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术和医药领域，具体为一段来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列；此外，本专利技术还涉及该游离DNA序列在制备包虫病(或棘球蚴病)检测和诊断产品中的应用。本专利技术受国家自然科学基金(81601792、81772224、81772225、81501771)及国家卫生健康委包虫病防治研究重点实验室开放课题(2020WZK2008)资助。

技术介绍

[0002]棘球绦虫(Echinococcus spp.)的幼虫寄生于人体可引起棘球蚴病(echinococcosis)，俗称为包虫病(hydatid disease)，是一种严重影响人体健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病，是我国重点防治的寄生虫病。其中细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)引起的棘球蚴病为囊型包虫病，占包虫病总数的98％。我国是包虫病流行最为严重的国家，全国包虫病流行县370个，流行区面积占国土面积40％以上，患病人数超过16万，受威胁人口数近6000万，均居全球首位，我国包虫病疾病负担占全球疾病负担的40％，为全球最高。
[0003]目前，对包虫病病人的诊断采用的是超声检查的方法，以发现包虫病特征性影像结合流行病学调查作为主要的诊断依据，对疑似病例进行血清免疫学辅助诊断。
[0004]超声检查为无创检查方法，是目前包虫病筛查诊断的首选方法，但仍存在一些问题，如实际检查中采用的腹部超声检查仅能对腹腔进行检查，不能发现腹部以外的病灶，检查过程中对操作人员的技术水平和临床经验要求高，易与肝囊肿、肝血管瘤、肝癌等混淆，且对于2cm以内缺乏特征影像结构的小囊无法诊断，从而导致漏诊或误诊。在包虫病影像不典型时，用免疫学检测作为辅助诊断方法。目前用于免疫学检测的抗原多为粗抗原，来源于囊液、原头蚴、囊壁等虫体成分，通常敏感性较高，但特异性不足，且常常与其他绦虫、吸虫有交叉反应，使得免疫学检测结果通常假阳性较高。
[0005]因此包虫病检测和诊断领域急需开发一种敏感特异的检测方法。基于特异性核酸标志物的分子生物学方法已在多种疾病中被证明是敏感、特异、高效的检测方法，在包虫病检测和诊断领域也已开展相关探索，通过聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR、荧光PCR、环介导等温扩增(LAMP)等方法进行检测和诊断。
[0006]分子生物学方法的关键点在于筛选获得敏感性和特异性都足够高的核酸标志物作为检测靶标，游离DNA(cell-free DNA)是存在于血液、尿液、唾液等体液中的细胞外游离状态的DNA分子，寄生虫源的游离DNA可能是虫体在生长、发育、成熟、崩解等过程中分泌或释放出的DNA分子进入宿主体液循环而产生的，虫源游离DNA已在疟原虫、弓形虫、血吸虫、锥虫等寄生虫研究中被证明是可作为寄生虫病检测或诊断的核酸靶标。
[0007]目前尚未有文献公开细粒棘球绦虫游离DNA序列作为包虫病(或棘球蚴病)检测和诊断的应用。

技术实现思路

[0008]本专利技术要解决的技术问题之一是提供一段来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列。
[0009]本专利技术要解决的技术问题之二是上述游离DNA序列的筛选方法。
[0010]本专利技术要解决的技术问题之三是上述游离DNA序列的应用。
[0011]本申请采用大通量基因组学测序结合生物信息学分析的方法，筛选得到了来自于细粒棘球绦虫的游离DNA序列，通过荧光定量PCR法初步鉴定了该DNA序列具有较高的敏感性和特异性，可应用于包虫病检测和诊断。
[0012]本专利技术解决上述技术问题采用的技术方案为：
[0013]在本专利技术的一方面，提供一段来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列，长度为101个碱基，其序列为SEQ ID NO.3所示序列：
[0014]GCAAGATCTTCACGAGCCTCAGAGAATTCACCTTCTTCCATGCCTTCACCGACGTACCAATGAACGAATGCACGCTTGCCGTACATAAGATCAAACTTGTG
[0015]作为本专利技术优选的技术方案，所述游离DNA序列是用囊型包虫病病人血浆游离DNA经基因组重测序技术结合生物信息学分析方法，再通过荧光定量PCR法在病人和健康人中验证后筛选得到的。
[0016]在本专利技术的第二方面，还提供上述一段来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列的筛选方法，包括如下步骤：
[0017]第一步，通过重测序技术从囊型包虫病病人血样中得到大量游离DNA序列；
[0018]第二步，通过生物信息学方法分析比对从中筛选出来源于细粒棘球绦虫的虫源游离DNA序列；
[0019]第三步，再通过荧光定量PCR方法在包虫病病人和健康人中验证后筛选得到。
[0020]作为本专利技术优选的技术方案，第一步具体包括如下步骤：
[0021](1)采用试剂盒对包虫病病人新鲜血浆游离DNA进行提取；
[0022](2)对电泳检测合格的DNA样本进行文库构建；
[0023](3)文库检验合格后进行双端测序。
[0024]作为本专利技术优选的技术方案，第二步具体包括如下步骤：
[0025](1)首先用预处理软件Trimmomatic进行数据过滤，去掉低质量数据，获得清洁测序数据；
[0026](2)然后将上述数据与参考基因组比对：先将清洁测序数据序列比对细粒棘球绦虫参考基因组信息，提取比对上的序列，与人参考基因组比对，将比对到人基因组的序列剔除，再与细粒棘球绦虫参考基因组比对，得到来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列；
[0027](3)对比6份来自不同囊型包虫病病人血样通过上述步骤(2)获得的数据中的游离DNA序列，提取在6份病人血样中均存在且丰度较高的游离DNA序列，得到候选游离DNA序列。
[0028]作为本专利技术优选的技术方案，第三步具体包括如下步骤：用包虫病病人和健康人血样作为阳性和阴性对照，通过荧光定量PCR方法对第二步筛选得到的虫源游离DNA序列的敏感性和特异性逐一进行验证，筛选出敏感性和特异性最优的一段游离DNA序列。
[0029]作为本专利技术优选的技术方案，第三步中，所述荧光定量PCR法中针对SEQ ID NO.3所示序列采用的PCR引物序列为：
[0030]F：GCAAGATCTTCACGAGCCTC，如SEQ ID NO.21所示；
[0031]R：CACAAGTTTGATCTTATGTACGGCA，如SEQ ID NO.22所示。
[0032]作为本专利技术优选的技术方案，第三步中，所述荧光定量PCR方法的反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15sec，40个循环；60℃退火30sec，40个循环。
[0033]作为本专利技术优选的技术方案，第三步中，所述荧光定量PCR方法的反应体系包括：2
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荧光定量试剂盒(罗氏)FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)5μl；ddH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一段来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列，其长度为101碱基，其序列为SEQ ID NO.3所示序列：GCAAGATCTTCACGAGCCTCAGAGAATTCACCTTCTTCCATGCCTTCACCGACGTACCAATGAACGAATGCACGCTTGCCGTACATAAGATCAAACTTGTG。2.如权利要求1所述的游离DNA序列，其特征在于，所述游离DNA序列是用囊型包虫病病人血浆游离DNA经基因组重测序技术结合生物信息学分析方法，再通过荧光定量PCR法在病人和健康人中验证后筛选得到的。3.如权利要求1或2所述的一段来源于细粒棘球绦虫的游离DNA序列的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，通过重测序技术从囊型包虫病病人血样中得到大量游离DNA序列；第二步，通过生物信息学方法分析比对从中筛选出来源于细粒棘球绦虫的虫源游离DNA序列；第三步，再通过荧光定量PCR方法在包虫病病人和健康人中验证后筛选得到。4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，第一步具体包括如下步骤：(1)采用试剂盒对包虫病病人新鲜血浆游离DNA进行提取；(2)对电泳检测合格的DNA样本进行文库构建；(3)文库检验合格后进行双端测序。5.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，第二步具体包括如下步骤：(1)首先用预处理软件Trimmomatic进行数据过滤，去掉低质量数据，获得清洁测序数据；(2)然后将上述数据与参考基因组比对：先将清洁测序数据序列比对细粒棘球绦虫参考基因组信息，提取比对上的序列，与人参考基因组比对，将比对到人基因组的序列剔除，再与细粒棘...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，曹建平，张璟，沈玉娟，伍卫平，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所国家热带病研究中心，
类型：发明
国别省市：